基于不同生长时期香港牡蛎转录组数据分析BMP蛋白家族的表达变化

农珍珍蒙扬辉陈肇聪蒋美君孙若鹏朱鹏覃波忠钟方杰张斌严雪瑜

(1.广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室/北部湾大学海洋学院，广西 钦州 535011；2.钦州市水产技术推广站，广西 钦州 535000)

香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)俗称“白蚝”，具有生长快、营养丰富、经济效益高等优点而被广泛养殖，其主要繁殖生长于我国南方低纬度、暖水性的沿海近岸[1]。随着牡蛎养殖行业的迅速壮大，其产量大幅度提升，但香港牡蛎出现生长缓慢、种质退化等问题变得严峻[2]，提高香港牡蛎的数量及质量迫在眉睫，成为当今热点研究方向。

转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族是一组调节肌肉生长发育、器官形成、受损组织修复、细胞凋亡等生物学功能广泛的细胞激素[3，4]。TGF-β超家族的成员数量众多[5]，根据其结构、作用与受体的不同，可分为TGF-β、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)、激活素(activins)、肌肉抑制素(myostatins)等，其中BMPs是TGF-β超家族里最大的亚家族成员[6]。诱导骨形成是BMP蛋白家族中最早被发现的功能，后被广泛用于兔、鼠、牛及人类等脊椎动物的研究。大量资料证明，BMP蛋白家族不仅促进动物骨骼相关方面的健康发育，还调控不同类型细胞的生理过程[7，8]，如生物胚胎发育、细胞增殖、分化等[9-11]。虽然BMP蛋白家族在脊椎动物方面的研究比较透彻，但随着时代发展的需求，其家族在软体动物的潜在功能的挖掘也得到了关注。原位杂交技术结果分析发现，BMP2基因在外套膜高表达，推测BMP2基因参与合浦珠母贝的贝壳珍珠层形成[12]。实时荧光定量PCR技术结果显示，BMP2/4基因在D型幼虫期和稚贝中表达水平偏高，认为BMP2/4基因与泥蚶的器官形成、生长发育有紧密的相关性[13]。栉孔扇贝(Chlamys farreri)中，BMP2基因在幼体原肠期的表达量最高；BMP2基因在成体的各组织中均表达，暗示BMP2基因参与调节胚胎发育、肌肉等组织的分化和生长等[6]。以上研究表明，BMP蛋白家族在软体动物体内的胚胎发育调控及贝壳形成等生理过程起关键作用。

通过转录组高通量测序技术(RNA-seq)可分析出各物种的不同发育时段、生理周期下某种基因时空表达模式的变化，进而挖掘某些具有特殊生理功能的未知基因[14]。近年来，该技术已被大规模应用于水产生物的生长发育、繁殖等方面的研究[15，16]。迄今，尚未有BMP蛋白家族在香港牡蛎不同生长时期表达变化的相关报道。为此，本研究通过对不同生长时期的香港牡蛎开展转录组测序，分析BMP蛋白家族中关键基因的表达变化，以期探寻到与香港牡蛎器官形成、肌肉发育和个体生长等方面关键候选基因，为培育出优质、高产、抗逆性强的香港牡蛎，提供育种技术理论研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

将广西茅尾海自然海区香港牡蛎群体作为亲本，在人工繁育条件下(盐度20‰，温度25℃)培育的香港牡蛎苗种投放到钦州大蚝保苗海区(E108°34′54.27″，N21°45′0.53″)中进行自然养殖，并定期监测香港牡蛎的生长情况[17]，采集4月龄(4M)和12月龄(12M)的香港牡蛎闭壳肌组织样品，置于液氮中速冻后储存于-80℃冰箱备用。

1.2 转录组测序及BMP蛋白家族基因表达分析

将香港牡蛎的闭壳肌样品在干冰保存状态下送往中国上海美吉生物技术公司进行cDNA文库构建和mRNA测序，并对转录组测序获得的BMP蛋白家族的基因按照p-adjust<0.001和|log2FC|≥1的标准进行差异表达分析，利用Graphpad prism 9软件绘制基因表达箱线图。

2 结果与分析

2.1 BMP1基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化

转录组数据分析结果显示，BMP1基因在香港牡蛎4月龄(4M)时的相对表达量均值为9.52，在12月龄(12M)时的基因表达量均值为6.19，表明BMP1基因表达随香港牡蛎的生长呈下降趋势，结果如图1所示。

图1 BMP1基因在香港牡蛎不同生长时期的表达情况

2.2 BMP2基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化

BMP2基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化结果如图2所示，在4M时BMP2基因的相对表达量均值为5.24，在12M时的基因表达量均值为2.53，表明BMP2基因表达随香港牡蛎的生长呈下降趋势；但转录组测序分析结果显示BMP2基因在香港牡蛎4M和12M时期的组内个体差异较大，其基因的时空表达情况仍需进一步验证。

图2 BMP2基因在香港牡蛎不同生长时期的表达情况

2.3 BMP3基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化

BMP3基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化结果如图3所示，在4M时BMP3基因的相对表达量均值为4.11，在12M时的基因表达量均值为1.06，表明BMP3基因表达随香港牡蛎的生长呈下降趋势；但转录组测序分析结果显示BMP3基因在香港牡蛎4M和12M时期的组内个体差异较大，其基因的时空表达情况仍需进一步验证。

图3 BMP3基因在香港牡蛎不同生长时期的表达情况

2.4 BMP7基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化

BMP7基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化结果如图4所示，在4M时BMP7基因的相对表达量均值为5.79，在12M时的基因表达量均值为4.16，表明BMP7基因表达随香港牡蛎的生长呈下降趋势；但转录组测序分析结果显示BMP7基因在香港牡蛎4M和12M时期的组内个体差异较大，其基因的时空表达情况仍需进一步验证。

图4 BMP7基因在香港牡蛎不同生长时期的表达情况

2.5 BMP10基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化

BMP10基因在香港牡蛎不同生长时期的表达变化结果如图5所示，在4M时BMP10基因的相对表达量均值为1.09，在12M时的基因表达量均值为1.44，提示BMP10基因表达随香港牡蛎的生长呈上升趋势。

图5 BMP10基因在香港牡蛎不同生长时期的表达情况

3 讨论

BMP蛋白家族中的基因在各生物体的细胞生长周期、胚胎发育等生理反应表现出一定的差异表达水平。相关报道表明，BMP1基因在爪蟾的桑椹胚到蝌蚪时期该基因表达逐渐增加[18]。BMP1基因在水牛的各组织中都有表达[19]。本研究中，BMP1基因在香港牡蛎4M时表达量极高。以上研究结果阐明，BMP1基因在不同物种胚胎发育前期可能发挥重要作用。对斑马鱼进行试验研究，发现BMP2基因早期的表达量高于后期，且斑马鱼的BMP2基因被敲低导致其器官发育缓慢或畸形，结果表明，BMP2基因在斑马鱼的胚胎发育中发挥了关键调控作用[20]。对九孔鲍进行试验研究，发现九孔鲍的BMP2基因于7个时期均表达，表达量主要集中于受精卵、4细胞、8细胞、原肠胚、稚鲍时期，推测BMP2基因在九孔鲍生长发育、器官形成中具有重要作用[21]。本研究中，香港牡蛎的BMP2基因在4月龄时表达量相对较高，表明BMP2基因可能在牡蛎的生长发育前期发挥关键作用。在非洲爪蟾(Xenopus laevis)相关试验中，发现BMP3基因具有抑制骨骼形成作用[22]。在合浦珠母贝试验中，发现BMP3基因在幼体的担轮幼虫期及变态期高表达；BMP3基因在成体的外套膜和鳃高表达，说明BMP3基因参与合浦珠母贝细胞的分化及贝壳形成[23]。本研究中，BMP3基因在香港牡蛎4M时高表达，12M时其表达量下降。BMP3基因在脊椎动物和软体动物的细胞分化、生长发育等生理活动中存在差异，原因可能是BMP3基因在各物种间生长发育中生理反应机制不同。RT-PCR技术分析结果显示，BMP7基因在泥蚶的各个发育阶段都有表达[24]；本研究中，BMP7基因在香港牡蛎不同生长时期的表达模式均显示，贝类各时期的生理调控离不开BMP7基因的参与。周代志等[25]发现，BMP10基因在合浦珠母贝中高表达于担轮期和变态期；段胜华的研究发现，BMP10基因在三角帆蚌的不同组织都有表达[26]；BMP10基因在香港牡蛎12M时的表达量最高，推测该基因参与贝类的变态发育、组织分化、生长发育等。

4 结论

本试验通过利用转录组高通量技术对香港牡蛎BMP蛋白家族关键基因开展时空表达差异分析，为BMP蛋白家族的功能探索奠定一定的理论基础。本研究发现，BMP1、BMP2、BMP3、BMP7基因在香港牡蛎4M时的表达量显著高于12M，说明这4个基因可能参与了香港牡蛎前期的生长发育过程。BMP10基因在香港牡蛎12M时的表达量高于4M时期，基因时空表达呈上升趋势，说明该基因可能在香港牡蛎后期的生长发育过程中有重要作用。本研究结果发现，BMP蛋白家族中的BMP1、BMP2、BMP3、BMP7和BMP10等基因在香港牡蛎不同的生长发育阶段具有表达差异，表明BMP蛋白家族可能参与了香港牡蛎的生长调控过程，为牡蛎的生长机理研究提供了新的思路。