基于小RNA高通量测序检测蕨麻病毒

2023-07-04田甜李军乔王鑫慈曲俊儒

安徽农学通报 2023年9期

田甜李军乔王鑫慈曲俊儒

摘要本研究旨在对危害蕨麻的病毒种类进行探究，明确引起蕨麻病毒病的主要病原。以青海蕨麻2号品种和青海蕨麻4号品系为研究对象，分别编号为“PA-2”和“PA-4”，利用小RNA测序技术对其进行高通量测序，对测序结果进行处理和拼接后进行生信分析，鉴定出病毒种类。结果显示，PA-2中共鉴定出9种病毒，其中悬钩子黄网病毒和覆盆子叶斑驳病毒为主要病毒；PA-4中共鉴定出8种病毒，其中主要病毒为覆盆子叶斑驳病毒、玫瑰黄脉病毒和悬钩子黄网病毒。经过候选病毒有效性检测，PA-4BF和PA-4GR中均检测出RLMV，分别比对到2 375 655条reads和1 838 987条reads，占小RNA的81.66%和82.08%，说明RLMV是侵染蕨麻的主要病毒。

关键词蕨麻；深度测序；病毒检测

中图分类号 S432.1 文献标识码 A

文章编号 1007-7731（2023）09-0127-07

植物病毒对植物而言是毁灭性的存在，病毒寄生于植物体内，破坏植物叶绿素、物质代谢以及使植物激素紊乱，导致植物可能出现叶色黄化、生长缓慢以及矮化等症状，严重者使植物死亡。至今已报道的病毒种类大概有1 100多种[1]，病毒侵染植物速度快而且传播途径多，一旦在植物中流行，就会造成严重的损失。因此，对植物进行病毒检测以预防病毒侵染在植物研究中显得尤为重要。目前，病毒检测手段已较为成熟[2-5]，小RNA深度测序在植物病毒检测中也被广泛应用[6]。小RNA深度测序鉴定病毒是利用植物寄主本身被病毒侵染时发生的RNA沉默反应产生的siRNA来鉴定病毒的存在以及通过序列比对确定病毒种类[7-8]。该方法省时、高效且不限制是DNA病毒还是RNA病毒，在植物病毒鉴定中发挥了巨大的作用[9-10]。

蕨麻（Potentilla anserina L.），俗称“人参果”，是蔷薇科鹅绒委陵菜属的一个变种，与其主要的区别特征是蕨麻的块根在高原地区可以膨大[11]。蕨麻内含丰富的营养物质，作为食品食用已有渊远的历史，在药用方面，蕨麻可以对肿瘤病毒的复制产生抗性[12]，具有护肝和增强免疫力的功效，是优质的“药食同源”的资源植物[13]。在西部高原地区，蕨麻种植产业是农牧民主要经济来源之一，蕨麻市场价为200～400 元/kg，经济效益较高。蕨麻在生态环境上可起到修缮土壤、防沙固土的作用，蕨麻根系和匍匐茎发达，耐旱、耐寒、克隆性强，生长速度快，因此在固土、涵养水源等方面能够发挥作用[11]。2021年8—10月，笔者在青海湟源县日月藏族乡蕨麻种质资源圃中采挖蕨麻时发现，蕨麻地上部分叶片出现皱缩、黄化、畸形以及部分坏死，地下块根部分出现畸形、变小以及色泽变差等疑似病毒病侵染的症状，有些蕨麻品种虽然叶片没有表现出症状，但地下块根有畸形、变小的表现，导致市场价值受到影响。研究发现，植物受到病毒侵染后，其内含成分会受到影响，或降低其主要有效成分[14]，从而影响蕨麻口感。蕨麻病毒病的研究目前相对较少，是一个非常值得挖掘研究的领域，基于在种植基地的观察，初步判断蕨麻的异常症状是由病毒侵染造成。为此，本试验采用小RNA深度测序对蕨麻进行病毒测序和鉴定，以明确蕨麻中的病毒种类，为后续病毒病的预防和研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

2021年9月17日，于青海省湟源日月藏族乡蕨麻种质资源圃采集疑似感病蕨麻，地上部分表现为脉黄、畸形以及皱缩，地下块根变小、畸形等症状（图1）。以青海蕨麻2号品种和青海蕨麻4号品系为研究材料，摘取叶片后，液氮快速冷冻，后带回实验室后存貯于-80 ℃冰箱中保存备用。将青海蕨麻2号样品编号为PA-2，青海蕨麻4号品系样品编号为PA-4。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理及小RNA测序。采用TRlzol试剂提取样品总RNA，经检测合格后，送至北京百迈客生物科技有限公司，委托其进行文库构建和小RNA深度测序。

1.2.2 原始数据过滤及18～30 nt小RNA筛选。对测序得到的原始数据进行筛选过滤，即将含有接头的序列以及低质量序列过滤掉。当植物被病毒侵染后，体内合成的小RNA主要长度在19～24 nt[8]。为了更高效率筛选出合适的序列，先将原始数据中18～30 nt的小RNA序列筛选出来得到clean reads，再将clean reads进行后续分析。

1.2.3 样品候选病毒分析。将筛选出的clean reads序列进行注释，去除掉能够与非编码数据库比对上的序列，剩余未知序列使用velvet进行序列拼接，拼接后得到较长的重叠群（contigs），与NCBI NT（NCBI non-redundant nucleotide sequences）数据库进行比对，得到高度同源序列，将没有比对到的数据与NCBI NR（NCBI non-redundant protein sequences）数据库比对，得到部分同源序列，后将在2个数据库中都比对到的序列，在GenBank Virus RefSeq核酸数据库（简单表示为“Virus RefSeq Nucletide”），GenBank Virus RefSeq蛋白数据库（简单表示为“Virus RefSeq Protein”）进行比对，得到与病毒同源的contings，根据其相似度和contigs比对数，初步评估为候选病毒。

2 结果与分析

2.1 RNA提取质量检测

使用Nanodrop和Agileng 2100对提取的蕨麻样品RNA进行质量检测，结果显示，样品PA-2和PA-4的RNA质量满足试验要求（RIN≥7，且28S/18S≥1.8）（表1）。

2.2 小RNA测序数据统计

质检合格的样本通过Small RNA测序后，样品PA-2中获得27 492 685条Raw Reads和25 068 078条有效reads（Clean reads），占Raw reads的91.18%；样品PA-4中获得29 769 472条Raw Reads和25 356 893条有效reads（Clean reads），占Raw reads 的85.18%（表2）。两者皆可用于后续生物信息学分析。

2.3 18-30 nt小RNA的条数

由表3可知，在采集到的2个样品PA-2和PA-4中，分别筛选到18～30 nt的小RNA数量为184 840条和219 614条，其中，22 nt、21 nt在样品中占比最高，在PA-2和PA-4中分别为21.32%、17.99%和19.06%、17.57%。主要以21 nt、22 nt数量最多（图2）。

2.4 小RNA的拼接与注释

利用Bowtie[15]软件，将Clean Reads分别与Silva数据库[16]、GtRNAdb数据库[17]、Rfam数据库[18]和Repbase数据库[19]进行序列比对，对小RNA进行分类注释。由表4可知，rRNA所占比例分别为35.30%（PA-2）和34.00%（PA-4），说明RNA没有降解，在植物样品中是质量较好的rRNA，文库构建合格[20]。2个样品中未知序列的占比都超过了60%，这可能与缺少蕨麻的全基因组有关。其他小RNA种类占比都较少，除tRNA最高（3.75%）外，其他都在3.00%以下。

在PA-2和PA-4中分别获得3 471、1 981条contigs，其中，PA-4在病毒核酸数据库中注释到2条contigs，PA-2中没有注释到；在病毒蛋白数据库中分别注释到92条和136条contigs（表5）。

2.5 候选病毒

由表6可知，PA-2中比对鉴定到9种病毒，其中，与悬钩子黄网病毒（Rubus yellow net virus，RYNV）同源的contigs最多，有36条；其次是覆盆子叶斑驳病毒（Raspberry leaf mottle virus，RLMV）和原绿球菌噬菌体P-TIM68病毒（Prochlorococcus phage P-TIM68），分别为20、18条；其他病毒比对结果均为10条以下。PA-4中共比对鉴定到8种病毒，悬钩子黄网病毒比对到的同源的contigs最多，有15条，其次是覆盆子叶斑驳病毒（Raspberry leaf mottle virus，RLMV）、番茄黄色斑驳相关病毒（Tomato yellow mottle-associated virus，TYMAV）以及玫瑰黄脉病毒（Rose yellow vein virus，RYVV），分别为13、12和11条，其他病毒比对到的同源的contigs较少，均在10条以下。

通过对蕨麻样品的候选病毒的初步筛选，PA-2F中鉴定到的RYNV和RLMV可能是其主要病毒。PA-4中主要病毒可能为RLMV、RYVV、RYNV以及TYMAV。对候选病毒进行有效性评估、鉴定发现（表7），RLMV在PA-2和PA-4中比对到的reads分别有2 375 655条和1 838 987条，占总参考序列的81.66%和82.08%，说明候选病毒有效，2种样品中均包含的主要病毒为RLMV。

3 结论与讨论

深度测序技术是目前植物病毒学研究的热点工具，因其高灵敏度和样品量少且快速检测的特点而广泛被应用[21]。本研究中，通过小RNA深度测序研究发现，小RNA长度集中于21～24 nt，小RNA的长度基本在此范围内[8]，结果可靠。后续分析发现，采集的样品中PA-2和PA-4分别检测到9种、8种病毒，经过候选病毒有效性检测可知，2个样品中均含有RLMV，比对到的reads分别有2 375 655条和1 838 987条，占比分别为81.66%、82.08%。其他病毒比对到的重叠群条数虽然多，但和有效性不成正比，说明蕨麻中可能含有多种复合病毒，但主要病毒为RLMV。

RLMV是新发现的一种暂定为closterovirus属的病毒[22]，在树莓中可以造成脆果、果实变小等严重影响，目前尚未在国内有过报道，而在波兰、波斯尼亚、美国等国家均有報道[23-25]，这与不同国家种植得主要产物不同有关。本研究中，通过序列比对和候选病毒有效性分析在蕨麻中发现了RLMV，是国内的首次相关报道。

蕨麻作为青藏高原特有植物资源，其在药用成分、食用营养成分以及生态价值等方面均有研究，是一种优良的植物资源[26-27]。观察发现，植物叶片出现皱缩、黄化、畸形，块根变小、畸形等疑似病毒感染症状。为探究原因，课题组在土壤成分变化、真菌细菌感染以及根腐病等方面做了研究，而在病毒上的研究尚未涉及，目前仍处于空白领域。调查同科植物病毒发现，蔷薇科植物中已研究的病毒种类较多，如在果树中的草莓[28]、树莓[29]、梨[30]、桃[31]，花卉中的玫瑰、月季[32]等都已有研究。RLMV在蔷薇科植物中已有研究，Miros?awa[24]对RLMV研究表明，其会造成树莓果实易碎、植物生长缓慢以及果实减少等影响，Diego等[25]同样在树莓中发现有RLMV，导致叶脉变黄，严重时导致植株死亡，在果实收获时，使果实变得易碎，从而影响产量和品质。本试验中，2个样品中都检测到RLMV，说明该病毒在蕨麻中已有一定的传播范围，蕨麻块根大小的变化以及畸形在很大程度上都与其有关。蕨麻在种植过程中，基本以块根无性繁殖进行播种，连作的耕田制度可能使土壤的营养成分发生变化[33]，蕨麻生长受到一定影响，再加上秋冬季节采挖时不能完全将土里的蕨麻块根采挖干净，使得部分蕨麻多年连续繁殖，给病毒的积累提供了条件，使得多种病毒复合侵染，积累在蕨麻中。病毒侵染造成蕨麻地上部分出现黄化、皱缩和坏死的症状，使得地上部分生物量减少，在秋季蕨麻地下块根膨大时，地上部分无法完全转化成营养提供给块根[34]，影响块根的膨大，造成块根畸形、变小，从而使经济价值下降。

研究发现，通过序列比对得到的病毒除了RLMV外，还包括RYNV和RYVV等，这些病毒在蔷薇科植物中均有研究和报道，也是同科主要病毒的组成部分[32]，这进一步说明测序结果可靠。研究还发现，病毒浸染植物并不总是单一侵染，大部分以复合侵染为主。病毒的复合侵染在植物中非常普遍，张永鹏等[35]对青海部分地区马铃薯病毒检测中发现，有2种病毒侵染的样品占检测样品的7.73%；杨小龙[36]对福建福清地区的马铃薯病毒检测中发现，同一植株有达3种病毒同时侵染；杨波[37]对新疆草莓研究中发现，有2种病毒复合侵染的比例达16.67%。本研究对蕨麻病毒检测中得到的病毒种类较多，样本虽为3个品种和品系的混合样，但不排除有复合侵染的可能，病毒的复合侵染可能造成蕨麻形态的多样变化以及地下部分的不同症状表现，共同作用而使得蕨麻形变，进一步对生态价值、经济价值以及药用和食用价值产生影响。尽早地发现病毒病原可以有效防预，减少损失，因此可在后续试验中对蕨麻病毒复合侵染情况做相关研究，更可以在不同品种中研究病毒的侵染情况，做到早发现、早防预。

病毒鑒定方法是发现植物病毒最重要的一环，尽管小RNA深度测序为植物病毒的检测提供了良好的平台，但大量的数据和小片段的拼接以及拼接使用的软件的不同会对拼接结果产生一定的影响[8]。再加上拼接的结果并不能完全是病毒的完整基因组，比对的片段有长有短，比对的一致性高低不一，还需要通过有效性检测，或通过PCR验证来初步确认病毒种类[38，39]。本研究中，RYNV在2个样品中均有最多条序列能与之比对，但其有效性却都不高。研究中还发现有Prochlorococcus phage P-TIM68，这可能与采样时未完全清除样品表面上的杂质有关。样品的采集和制备在小RNA病毒检测测序中也是非常重要的一环，RNA容易降解且制备过程中易污染，因而需要格外注意RNA的质量[21，40]

蕨麻作为青藏高原地区特色植物，在多方面均已有研究，而对近年来出现疑似感病症状的研究相对较少，因此，从病毒学角度来探究引起蕨麻症状的原因以及找出病原是目前较为迫切的研究。植物病毒繁殖快、变异率高、分布和传播途径都较广泛，而目前对植物病毒的防预主要采用早发现、早防预的对策，加之缺少有效的防治药剂使得病毒成为生产上的难题[41-42]，因此，尽早发现病毒可以有效对植物进行早期预警和综合防治，减少损失。在后续研究中，可将研究方向集中于对得到的病毒种类设计引物进一步验证病毒的存在以及明确病毒的侵染性强弱、病毒的侵染是否为大范围的暴发、病毒的侵染是否会对蕨麻的药用成分、食用成分和生态价值造成影响以及有什么样的影响等。

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