苹果矮化砧组织培养研究进展

阿拉坦图雅 张丽 王园琳 白国栋 段磊

摘要 苹果矮化密植具有产量高、品质优、丰产早、管理方便、土地利用率高等优点，是苹果产业的发展趋势。本文主要针对苹果矮化砧的组织培养技术要点进行综述，包括如何选择适宜的外植体、培养基和培养条件，在培养过程中植物生长调节剂对组织生长的影响以及污染、玻璃化、褐化的预防等关键技术。

关键词 苹果矮化砧；植物组织培养；培养条件

中图分类号 S511   文献标识码 A

文章编号1007-7731（2023）09-0021-04

苹果（Malus pumila Mill.）是蔷薇科（Posacea）苹果属（Malus Mill.）的多年生木本植物，是世界四大水果之一[1]。苹果矮化密植栽培可以有效提高土地利用率，且具有早果、丰产、优质、管理方便、更新快等优点[2]。目前，我国苹果矮化砧木主要采用M9、M26和GM256等作为中间砧或者自根砧。GM256是吉林省农业科学院果树研究所利用‘西伯利亚酸苹果‘美國酸苹果与M系进行杂交培育而成的，具有抗寒抗病、早果丰产、亲和力强等特点[3]。M9是英国东茂林试验站选育出来的应用较为广泛的一种矮化砧木[4]，早果性强、耐盐碱，但抗逆性差[5]。M26是M9与M系其他砧木杂交选育出的在我国应用最多的砧木[6]，抗花叶病、白粉病[7]。苹果矮化砧木的组培快繁因其周期短、成本低、繁殖系数高等特点而被广泛利用。本文综述了苹果矮化砧木组织培养技术研究概况，为工厂化育苗提供参考。

1 外植体的选择

外植体的选择是进行组织培养、建立无菌体系以及植株再生的关键一步。尽管所有的植物细胞都具有全能性，但并不是任何细胞都能表现处理[8]。覃兰英等[9]用茎尖及侧芽为外植体，生根率高达98%～100%。张秀英等[10]通过人工气候箱进行恒温热处理35 d，待盆栽苹果苗顶芽或腋芽萌发长度达到0.5～2 cm时，取茎尖及芽点进行培养的组培苗染菌率低至0。时保华等[11]研究表明，枝条的再生多半从叶背面的基部中脉处开始，然后是细脉和其他部位。在组织培养的过程中，第一步也是最为关键的一步，即做好外植体的选择。为此，在进行外植体选择过程中，需要从多方面进行考虑，如材料本身的幼化程度、材料的着生部位以及自身的生理状态等。

2 培养基和培养条件的选择

2.1 培养基

苹果组培快繁初代培养和继代培养大多以MS、QL培养基为主，生根培养采用1/2WPM、1/2MS培养基。孙清荣等[12]开展了MS、1/2MS、3/4MS、QL 4种培养基对GM256试管苗生长的影响研究，结果表明，QL培养基增殖倍数最高，伸长生长最佳。孙洪雁等[13]对苹果矮化砧木JM7的组织培养中发现，MS比QL显著提高增殖梢数，但QL比MS更有利于获得健壮生长的绿苗。韩红岩[14]试验表明，苹果离体再生MS的效果优于其他培养基，所以一般选用MS作为基本培养基。

2.2 培养条件

封明军等[15]研究发现，苹果矮化砧‘T337叶片暗培养7～14 d时，形成的愈伤组织转入光照培养后增殖速度快，颜色鲜艳有光泽。师校欣等[16]研究认为，M26继代苗接种10 d后进行10～15 d的黑暗培养，可有效提高出苗率，不影响试管苗质量。查仁明[17]在进行苹果组织培养过程中发现，其最适宜的温度范围在不同的情况存在区别，在光照环境下，适宜温度为25～28 ℃；在黑暗的情况下，适宜温度在18～25 ℃。

3 植物生长调节剂对组织培养的影响

在进行植物组织培养过程中，应明确要想让植物组织培养质量得以提升，需要在基础培养基中加入一定量的植物生长调节剂，促进外植体中存在的愈伤组织部位实现组织的诱导以及器官的有效分化。当前常见的植物生长调节过程中，所使用的调节剂有生长素、细胞分裂素2种。应用在苹果组织培养基中，大多数情况下均会选择的细胞分裂素有6-苄基腺嘌呤（6-BA）、呋喃氨基嘌呤（KT）等，生长素有萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。

3.1 初代培养

苹果矮化砧木组织培养多以嫩梢、一年生枝条、叶片为外植体。王淼淼[18]研究发现，苹果矮化砧木启动培养的植物生长调节剂配比为MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L。余亮[19]对M9、M26的离体新梢初代培养进行研究，结果表明，其最佳培养基均为MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.50 mg/L。杨艳敏等[20]研究发现，MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L为GM256的最佳诱导培养基，诱导率达78.5％。综上所述，苹果矮化砧木初代培养基以MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05～0.50 mg/L为主。

3.2 增殖培养

成思琼等[21]研究认为，M26最佳增殖培养基配方为MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.05 mg/L。周莉[22]研究发现，苹果矮化砧木M9的培养基配方MS+6-BA 0.60 mg/L+IBA 0.50 mg/L时，其有效新梢个数达到 6.8个/株。孙清荣等[23]研究认为，半矮化砧木‘54-118无菌苗的适宜增殖培养基为QL+6-BA 1.00 mg/L+IBA 0.30 mg/L，增值系数达到5.1。

3.3 生根培养

赵亮明等[24]研究表明，苹果砧木M9、M26生根培养基为1/2MS＋IBA 0.30 mg/L＋NAA 0.10 mg/L时，生根率分别达到70.6％、69.6％。郑亚杰等[25]研究认为，GM256最适宜的生根培养基是1/2 MS+IBA 0.50 mg/L。韩秀清[26]研究表明，M9-T337的生根培养基1/2MS+IBA 0.50 mg/L+IAA 0.50 mg/L时，生根率最高达96%以上。综上所述，苹果砧木生根培养过程中以1/2MS＋IBA 0.30～0.50 mg/L的基础上，配备其他植物生长调节剂效果显著。

4 存在的问题

4.1 污染

在进行植物组织培养过程中，培养所面对的污染来源主要包括以下2个方面。一是由于材料本身所造成的。由于材料在使用过程中存在消毒不够彻底或者是材料内生菌的问题，导致其跟随材料直接被带入了培养基中。二是在开展无菌操作的过程中，由于培养容器的使用不当，导致外界环境中的空气或是细菌直接进入到培养基中，出现污染现象[8]。为此，要想解决植物组织培养过程中存在的污染问题，需要选择幼嫩材料，避开雨季和中午阳光最强时候取外植体，同时选择适宜的消毒液，控制好消毒时间，按程序规范操作，可有效降低污染风险。

4.2 褐化

由于苹果中本身含有一定数量的酚类化合物，一旦出现苹果离体这一现象，酚类化合物就会与空气发生反应，进而导致苹果本身的褐化现象相对较为严重。褐化的发生与基因型、外植体的生理状态、培养基、温度和光照、外植体大小、外植体组织的受伤程度、材料转移时间都有一定的关系。苹果離体再生过程中，褐化率随着消毒时间的增加而增加，最佳消毒时间为8 min，褐化率为23.33%[27]。为了克服苹果组织培养中的褐化现象，将苹果外植体放置在5 ℃以下的环境进行低温预处理，这是由于低温能够减缓褐化反应的发展速度[28]。活性炭是当前较为常见的一种吸附性极强的无机吸附剂，其可以在短时间内吸收环境中存在的微量物质或微小颗粒，同时活性炭也可以用来减缓苹果外植体的褐化反应[29]。在外植体褐化防治过程中，可以选择无菌的维生素C溶液对外植体进行浸泡，要求浸泡时间在20 min以上。通过这种方式可以有效防止苹果外植体褐化速度过快这一问题，而在选择维生素C溶液时，需要确保其浓度处于适宜的范围，应在25 mg/L[18]。

4.3 玻璃化

试管苗玻璃化的因素包括培养基的成分、光照、温湿度及封口材料的透气性。乔纳金苹果茎尖培养时，一定范围内降低培养基中铵态氮，增加硝态氮的比例有利于防止玻璃苗发生[30]。较高浓度6-BA是引起苹果砧木试管苗玻璃化的因素之一，6-BA的浓度范围以0.4～0.7 mg/L较适宜。同时空掉组培瓶内水分，降低瓶内湿度，可减少玻璃苗的产生[31]。查仁明[17]研究认为，当琼脂浓度0.7%以上时，玻璃化现象趋于消失。师校欣等[32]研究认为，苹果砧木试管苗继代培养基中添加1.5～2.0 g/L的聚乙烯醇，可以有效防止玻璃苗。

5 应用及展望

近年来，为了提高单位面积产量以及提高土地利用率，苹果矮化密植技术已经成为主流，相比于传统的栽植技术，矮化密植栽培具有早果性强、产品质量更高、更便于集约化管理等优势。在开展苹果矮化密植栽培技术的过程中，首先是尽可能地对苹果品种进行分析，选择1个最适合矮化的砧木，以生产出更多优质的矮化砧木，提高苹果矮化密植过程中的整体质量，这也是苹果矮化密植技术的最为关键的环节之一。

苹果矮化砧组织培养技术应用在苗木生产过程中，可以培育出性状稳定、纯度更高、无病毒的优质砧木。通过对苹果矮化砧木组织培养关键技术环节的优化和完善，实现苹果矮化砧脱毒苗的工厂化生产，为苹果矮化密植提供大量的优质苗木，应用前景广阔，对发展苹果产业发展的意义重大。

参考文献

[1] 路秋农，贾定贤.中国果树志·苹果卷[M].北京：中国农业科技出版社，中国林业出版社，1999.

[2] 鄢新民.苹果矮化密植栽培的主要途径和意义[J].现代农村科技，2011（24）：76.

[3] 林淑芳.抗寒苹果矮化砧GM256简介[J].农村天地，2002（8）：27.

[4] 宣景宏.M8和M9在苹果矮化砧木育种中的应用[J].北方果树，2001（4）：1-4.

[5] 杨蕊.几种苹果矮化砧自根砧苗繁殖技术的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2013.

[6] 高彦，白海霞.苹果矮化砧M9品系的特点及应用情况[J].西北园艺（果树），2010（6）：34-35.

[7] 张庆田.几种苹果砧木组织培养技术的研究[D].泰安：山东农业大学，2007.

[8] 沈海龙. 植物组织培养[M].北京：中国林业出版社，2005.

[9] 覃兰英，徐光霞，邓世秀.苹果矮化砧的组织培养[J].植物生理学通讯，1981（5）：35-36.

[10] 张秀英，张丹，马勉娣，等.苹果组培外植体获取及培养试验研究[J].云南农业科技，2021（5）：7-8.

[11] 时保华，付润民，赵政阳，等.苹果叶片离体培养研究[J].西北植物学报，1995（1）：67-72.

[12] 孙清荣，孙洪雁，李林光，等.苹果矮化砧 GM256 高效快繁技术体系的建立[J].中国农学通报，2014，30（7）：95-99.

[13] 孙洪雁，孙清荣，李国田，等.苹果矮化砧木‘JM7的组织培养及其离体叶片不定梢再生[J].植物生理学报，2014，50（6）：779-784.

[14] 韩红岩.内蒙地区苹果主栽品种组培再生体系的建立[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2006.

[15] 封明军，雷富臣，豆静，等.苹果矮化砧‘T337组织培养及愈伤组织诱导体系研究[J].塔里木大学学报，2021，33（4）：45-52.

[16] 师校欣，杜国强，高仪，等.黑暗培养对苹果组培快繁及叶片再生的影响[J].河北农业大学学报，2004（4）：18-21.

[17] 查仁明.苹果属植物组织培养研究进展[J].重庆师专学报，2001（2）：105-107.

[18] 王淼淼.几种新型苹果矮化砧木的组培快繁技术研究[D].保定：河北农业大学，2015.

[19] 余亮.蘋果砧木 M9 和 M26 快繁体系的建立及移栽生理的研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2013.

[20] 杨艳敏，魏永祥，刘成，等.苹果矮化砧木组织培养及脱病毒技术[J].北方园艺，2016（4）：107-112.

[21] 成思琼，颜盟，梁彬，等.苹果砧木M26和M9-T337组培快繁体系的建立[J].陕西农业科学，2020，66（4）：31-35.

[22] 周莉.苹果矮化砧木离体培养和快繁体系建立与优化[D].杨凌：西北农林科技大学，2017.

[23] 孙清荣，关秋竹，孙洪雁，等.苹果抗寒半矮化砧木‘54-118的组织培养及其离体叶片不定梢再生[J]. 植物生理学报，2017，53（11）：2007-2012.

[24] 赵亮明，王飞，韩明玉，等.苹果砧木组织培养与快繁技术研究[J].西北农业学报，2011，20（7）：118-122.

[25] 郑亚杰，姚环宇.苹果矮化砧GM256组织培养与快繁技术研究[J].吉林农业科学，2008（1）：26-27，32.

[26] 韩秀清.苹果矮化砧M9-T337组培快繁技术[D]. 杨凌：西北农林科技大学，2019.

[27] 宋春晖，谢贝阳，董志丹，等.柱状苹果组培外植体褐化控制与不定芽诱导方法探索[J].分子植物育种，2020，18（16）：5459-5465.

[28] 曾镭，刘燕.植物组织培养中褐化问题的研究进展[J].安徽农学通报，2007（14）：49-50.

[29] 郭艳，杨海玲.植物组织培养中的褐化现象及解决途径[J].山西农业科学，2009，37（7）：14-16，31.

[30] 程家胜，史永忠，张志云，等.苹果组织培养中的玻璃苗问题（简报）[J]. 植物生理学通讯，1990（1）：33-35.

[31] 高遐虹，李梅，张桂凤.苹果砧木试管苗发生玻璃化的因素及预防[J].北京农学院学报，1997（2）：16-19.

[32] 师校欣，陈四维，马宝焜，等. 苹果砧木离体培养中玻璃化问题的研究[J]. 河北农业大学学报，1990（3）：12-16.

（责编：张宏民）

作者简介 阿拉坦图雅（1980—），女，内蒙古赤峰人，研究员，从事林业科研工作。