马铃薯试管苗病毒检测技术研究

梁杰 李功义

摘要 根据大兴安岭马铃薯种薯生产实际，应用酶联免疫吸附检测法（ELISA）检测茎尖组织培养试管苗的带毒情况，鉴定危害马铃薯生产的6种主要病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV），并结合指示植物如千日红进行最后鉴定，筛选健康、无毒的试管苗，为切段扩繁及试管薯生产作准备。该方法简单易操作，可作为国内生产脱毒种薯单位的标准检测方法进行推广。

关键词 马铃薯试管苗；病毒检测；酶联免疫吸附检测法；指示植物接种鉴定法

中图分类号 S532 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）19-0081-01

在生产上，马铃薯以无性繁殖为主，种植过程中容易感染病毒，并通过块茎世代传递，导致病害逐年加重、马铃薯产量和品质下降[1]。由于脱毒苗有再侵染的可能，对基本无毒核心苗进行连续跟踪检测[2-3]，以保证试管苗质量。对黑龙江省主栽马铃薯品种脱毒试管苗按株系进行检测筛选，采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳方法（R-PAGE），检测主栽品种脱毒试管苗带类病毒状况，筛选出无类病毒的试管苗株系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

马铃薯试管苗材料来源于黑龙江省大兴安岭地区农林科学院组培室，以东农303、早大白、费乌瑞它、尤金、中薯一号、大西洋、郑薯6号、克新13号、诺兰、中薯3号、中大一号马铃薯试管苗作为检测样品；马铃薯病毒检测试剂盒购于瑞士，由苏庆祥（博士）代购。

1.2 仪器和设备

聚苯烯微量滴定板（96孔）、酶联检测仪、微量可调进样器（0.5～10.0 ？滋L、10.0～40.0 ？滋L、40.0～200.0 ？滋L 3个规格）及相应规格的塑料头、电光天平（精确到0.1 mg）、冰箱、培养箱（温度定为37 ℃）、瓷研钵。

1.3 试剂及配制方法

试剂为分析纯，用水为蒸馏水。

抗体免疫球蛋白（r-globulin）和酶标抗体（Coniugate）：从某一马铃薯病毒抗血清提取的免疫球蛋白，用辣根过氧化物酶标记的某一病毒的免疫球蛋白的酶标记抗体，一般使用浓度常在1∶1 000以上。贮藏于4 ℃条件下备用。

碳酸盐包被缓冲液：pH值9.6，取无水碳酸钠（Na2CO3）1.59 g与碳酸氢钠（NaHCO3）2.93 g，定溶于1 L蒸馏水中。

PBS-Tween20缓冲液：pH值7.4，用于洗涤微量滴定板。配制方法为氯化钠（NaCl）8 g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g、七水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·7H2O）2.2 g[或十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.9 g]、氯化钾（KCl）0.2 g、迭氮化钠（NaN3）0.2 g，加水至1 L，然后加0.5 mL Tween-20。

样品缓冲液为PBS-Tween20+2%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。底物缓冲液：0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O溶液25.7 mL+0.1 mol/L柠檬酸溶液24.3 mL+水50 mL，pH值5.0，临用前加邻苯二胺40 mg、30%H2O2（过氧化氢）0.15 mL，混匀，避光放置，应为白色或微黄色溶液。

终止液：碱性磷酸酯酶用3 mol/L NaOH中止，辣根过氧化物酶用2 mol/L H2SO4终止。

1.4 试验设计

（1）酶联免疫吸附检测法。设定2个阴性对照A1、B1， 2 个阳性对照C1、D1，2个空白E1、F1。取东农303、早大白、郑薯6号、费乌瑞它、尤金、中薯一号、大西洋、克新13号、诺兰、中薯3号、中大一号马铃薯试管苗，每个品种取8支试管苗进行检测，分别标记为1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、10号、11号，1号试管苗第1支记为11号、1号试管苗第8支记为18号，以此类推。

（2）指示植物接种鉴定法。取各参试马铃薯品种试管苗汁液作为检测样品，接种于千日红叶片，检测6种主要病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV）。

1.5 操作方法

1.5.1 酶联免疫吸附检测法。

（1）包被微量滴定板。將免疫球蛋白用包被缓冲液按1∶1 000稀释，用微量进样器向微量滴定板的每一样品孔内加入稀释的免疫球蛋白200 ？滋L，在37 ℃条件下孵育4 h或在4 ℃条件下过夜。

（2）洗涤包被的微量滴定板。甩掉微量滴定板中的免疫球蛋白稀释液，再在一叠吸水纸上敲打微量滴定板。向微量滴定板的样品孔中加满洗涤液，停留3 min，甩掉洗涤缓冲液，共洗涤3次，以除尽未被吸附的免疫球蛋白。

（3）加被检测的样品。在无菌条件下，从试管苗上剪下长2 cm茎段，放在小研钵内，将取样后的试管苗放回试管中并封口，对样品编号，以便根据检测结果取舍。向小研钵中加样品缓冲液，加入的量根据上样孔数而定，研磨。每孔加200 ？滋L检测样品，每1块微量滴定板上可设置阳性对照1个、空白对照1个，37 ℃孵育4 h或4 ℃条件下过夜。

（4）显色。洗板后，加入用样品缓冲液1∶1 000稀释的酶标记抗体，每孔加200 ？滋L；再洗板，然后加入底物缓冲液100 ？滋L，当一些样品孔间显现不同颜色时，加入50 mL终止液。

（5）读取结果。一是目测观察。显现颜色深浅与病毒相对浓度成正比。显现白色为阴性反应，记录为“-”；显现淡橘红色为阳性反应，记录为“+”，依色泽逐渐加深记录为“++”和“+++”。二是用酶联检测仪测定光密度值。样品孔的光密度值大于阴性对照光密度值的2倍，即确定为阳性反应（阴性对照孔的光密度值应≤0.1）。

1.5.2 指示植物接种鉴定法。2017年3月10日，用磷酸缓冲液提取试管苗汁液，用600目金钢砂均匀喷洒在叶子表面，用脱脂棉做成小棉棒，用镊子夹着蘸取汁液摩擦接种在千日红（Gomphrena globosal）离体叶片上，及时用清水冲掉接种叶片上的杂物。6～7 d后，逐日观察症状反应。没有表现出明显病毒症状，说明脱毒基础苗病毒含量低或没有。

2 结果与分析

2.1 酶联免疫吸附检测法

检测样品提取液注入凹槽为200 μL，酶联免疫吸附检测法（ELISA）鉴定PVX病毒，只有含PVX浓度较高，超过对照阳性样品含量，才视为含PVX。由病毒颜色反应可以看出，1号（A2-H2）、2号（A3-H3）、3号（A4-H4）、4号（A5-H5）、5号（A6-H6）、6号（A7-H7）、7号（A8-H8）、8号（A9-H9）、9号（A10-H10）、10号（A11-H11）、11号（A12-H12）马铃薯样品均不含PVX。田间未发现其他几种病毒表现出症状，故未检测。

2.2 指示植物接种鉴定法

千日红为鉴定PVX的最有效指示植物。试验结果表明，接种叶片上有明显紫红色环状枯斑症状，说明大西洋试管苗含马铃薯X病毒（PVX）。

3 结论与讨论

试验结果表明，用酶联免疫吸附技术（DAS-ELISA）结合指示植物鉴定筛选脱毒基础苗，方法简单易操作，可作为国内生产脱毒种薯单位的标准检测方法进行推广。

采用酶联免疫吸附技术，从瑞士引进马铃薯病毒检测试剂盒（PVX、PVY、PVS、PLRV），应用Coda全自动酶免系统，除人工包板、研样外，加样、洗板、加酶标、洗板、加底物、孵育、洗板等一系列工作都在计算机操纵下进行，一次能检测3块板270个样品，减少了工作环境和人为误差，大大提高了检测质量、速度、数量，实现了大规模种薯检验，保证了脱毒种薯质量[4-5]。指示植物接种鉴定法较常使用，主要根据病毒在指示植物上的症状，但要花费较多时间，一般为6～7 d。此外，在寄主上的症状表现还受环境（如温度、光强度等）影响，会阻碍指示植物鉴定法快速对病毒病的预测，一般只作为定性检测手段[6]。

4 参考文献

[1] 吴凌娟，张雅奎，温福君，等.马铃薯茎尖脱毒技术在大兴安岭种薯生产上的应用[J].中国马铃薯，1998（3）：35-37.

[2] 蒋先林，杨鲁生，丁云双，等.低纬高原马铃薯脱毒种薯标准化生产技术[J].安徽农业科学，2013，41（35）：13506-13509.

[3] 左晓斌，邹积田.脱毒马铃薯良种繁育与栽培技术[M].北京：科学普及出版社，2012.

[4] 郭志乾，吴林科，赵永峰.马铃薯优良品种及配套栽培技术[M].银川：宁夏人民出版社，2009.

[5] 劉在东.马铃薯Y病毒分子检测试剂盒的研制及株系普查[D].沈阳：东北农业大学，2008.

[6] 张丽珍，董家红，郑宽瑜，等.云南省马铃薯脱毒试管苗和微型薯病毒检测与分析[J].中国马铃薯，2015，29（1）：42-45.