马缨杜鹃炭疽病病原菌生物学特性及防治药剂筛选

胡 珊，莫维弟，周志成，丁海霞,3，彭丽娟

(1 贵州大学 烟草学院/贵州省烟草品质研究重点实验室,贵州 贵阳 550025；2 贵州大学 农学院,贵州 贵阳 550025；3 贵州省农业生物技术重点实验室/贵州省农业科学院,贵州 贵阳 550006)

贵州百里杜鹃自然保护区位于贵州大方县与黔西市交界处(E 105°45＇30″～106° 04＇ 45″，N 27°08＇ 30″～27° 20＇ 00″)，保存有地球同纬度范围内中低海拔区面积最大的天然杜鹃林[1]。马缨杜鹃RhododendrondelavayiFranch 是该保护区的建群种和优势种，面积约25.16 km2，占百里杜鹃林区总面积的20%。马缨杜鹃又名马缨花，是杜鹃花科Ericaceae 杜鹃属Rhododendron的一种常绿灌木或小乔木[2]。因花大、颜色鲜艳，且形似马头饰上的璎珞而得名。其分布广泛，花色艳红，观赏价值高，是杜鹃属重要的育种亲本，具有较高研究利用价值[3]。但随着旅游业发展，频繁的人为活动使杜鹃花病害发生日益严重，不仅对观赏性产生影响，对物种的生存也产生了威胁。因此，开展马缨杜鹃病原菌生物学特性研究以及室内药剂的筛选，对该病害防治具有重要意义。

杨秀梅等[4-5]调查发现云南省昆明市晋宁区高山杜鹃盆花种植基地炭疽病Colletotrichum boninense、枯梢病Neofusicoccumparvum发生严重，田间发病率达20%以上。Wang 等[6]对台湾地区杜鹃花调查发现春秋季节杜鹃叶肿病Exobasidiumjaponicum发生严重，该病原菌导致杜鹃幼嫩组织发育受损，对杜鹃花产业具有极大破坏性。童俊等[7]对武汉周边以龟峰山景区为代表的杜鹃自然群落的主要病虫害进行了系统调查，发现杜鹃叶肿病、黑斑病Cercosporarhododendri发生严重。刘浩凯等[8]调查发现浙江省景宁县上山头云锦杜鹃叶斑病Phomopsisasparagi频繁发生，严重影响了杜鹃林的健康生长和景观效果。胡芳菲[9]对吉安市苗圃几种常见树木病害进行调查发现，西洋杜鹃褐斑病Ce.rhododendri发生相对较严重，苗期发病会造成植株整株死亡。陈明珠等[10]调查发现，贵州省贵阳市凤凰山锦绣杜鹃叶肿病发生严重，发病率高达80%，严重影响其观赏性。研究大多聚焦于不同种类杜鹃花病害调查和病原菌鉴定，关于杜鹃病害的生物学特性及防治药剂筛选研究较少。任纬恒[11]对百里杜鹃花腐病Alternariaalternata进行了室内药剂防治筛选，认为咪鲜胺、异菌脲、苯醚甲环唑、戊唑醇4 种药剂是可进行花腐病防治的候选药剂。

笔者于2021年7月在贵州百里杜鹃自然保护区进行病害调查，发现了1 种杜鹃真菌病害，经多基因构建系统发育树并结合形态特征，确定该病害是由松针炭疽菌Colletotrichumfioriniae引起[12]。为明确该真菌的生物学特性及适宜防治药剂，采用菌丝生长速率法对松针炭疽菌生物学特性进行研究，同时测定10 种杀菌剂对该病原菌室内毒力及2 种药剂混配对病原菌的联合毒力，了解松针炭疽菌生物学特性，筛选出有效抑制该病原菌菌丝生长的药剂，以期为贵州百里杜鹃自然保护区马缨杜鹃炭疽病的科学防治提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

于2021年7月从贵州省百里杜鹃自然保护区采集马缨杜鹃具有典型炭疽病症状的叶片，带回实验室进行分离培养，经贵州大学烟草品质研究重点实验室分离、鉴定并保存。

供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯蔗糖(P S A) 培养基、燕麦片琼脂(OMA)培养基、查氏(Czapek)培养基和高氏1 号(GSA)培养基[13]。PDA 培养基用于培养病原真菌、生物学测定及室内药剂筛选等试验。PSA、OMA、Czapek、GSA 培养基用于病原菌生物学特性测定。

供试药剂：22.7% (w) 二氰蒽醌SC(江西禾益化工股份有限公司)、25.0% (w) 吡唑醚菌酯SC(江苏托球农化股份有限公司)、25.0% (w) 溴菌腈EC(江苏托球农化股份有限公司)、50.0% (w) 丙环唑ME(青岛格力斯药业有限公司)、10.0% (w) 苯醚甲环唑WDG(先正达南通作物保护有限公司)、75.0%(w) 肟菌·戊唑醇 WDG(拜耳作物科学有限公司)、0.3% (w) 四霉素AS(辽宁微科生物工程股份有限公司)、80.0% (w) 乙蒜素EC(南阳新卧龙生物化工有限公司)、1.0% (w) 蛇床子素ME(云南南宝生物科技有限责任公司)及8.0% (w) 宁南霉素AS(德强生物股份有限公司)。

1.2 病原菌生物学特性

采用菌丝生长速率法[13]测定不同培养基对病原菌菌丝生长的影响，将直径为6 mm 的菌饼分别转接于PDA、Czapek、OMA、PSA 和GSA 培养基，置于25 ℃恒温培养箱黑暗培养7 d 后，测量各培养基上的菌落直径。每处理4 皿，重复3 次。

取直径为6 mm 菌饼置于PDA 培养基中央，分别放入5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒温培养箱黑暗培养7 d 后，十字交叉法测量菌落直径[13]，得到菌丝生长适宜温度，每处理4 皿，重复3 次。

将直径为6 mm 菌饼分别接种到pH 为5、6、7、8、9、10、11 的PDA 培养基(用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 进行调节)，置于25 ℃恒温培养箱暗培养7 d 后，测量菌落直径，得出菌丝生长适宜pH，每处理4 皿，重复3 次。

以Czapek 培养基为基础培养基[13]，分别以等质量的果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麦芽糖替代Czapek 培养基中的蔗糖作为碳源，以等质量的硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、硝酸钾、磷酸二氢铵替换Czapek 中的硝酸钠作为氮源，以不添加碳源和氮源的Czapek 为对照，25 ℃恒温箱黑暗培养7 d 后测量菌落直径，筛选最适碳、氮源。每处理4 皿，重复3 次。

1.3 室内药剂毒力

1.3.1 单剂毒力测定 采用菌丝生长速率法测定10 种杀菌剂(6 种常用化学药剂和4 种生物农药)对马缨杜鹃炭疽病菌的抑菌活性。供试药剂母液用无菌水溶解稀释，分别设置 5 个质量浓度梯度。二氰蒽醌为1 271.00、635.60、317.80、158.90、79.45 mg/mL；吡唑醚菌酯为0.300 0、0.150 0、0.075 0、0.037 5、0.018 8 mg/mL；溴菌腈为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 mg/mL；丙环唑为10.000、5.000、2.500、1.250、0.625 mg/mL；苯醚甲环唑为4.8、2.4、1.2、0.6、0.3 mg/mL；肟菌·戊唑醇为1.200、0.600、0.300、0.150、0.075 mg/mL；四霉素为3.000 0、1.500 0、0.750 0、0.375 0、0.187 5 mg/mL；乙蒜素为400、200、100、50、25 mg/mL；蛇床子素为20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg/mL；宁南霉素为80、40、20、10、5 mg/mL。

在无菌操作条件下，将不同质量浓度的杀菌剂溶液分别加入到灭菌的PDA 培养基中，充分摇匀后等量倒入培养皿(直径为85 mm)中，制成含有相应质量浓度药剂的平板，以加入等量无菌水的PDA培养基为对照。将供试病原菌接种于PDA 培养基上培养5 d 后，取直径为6 mm 菌饼分别置于含不同质量浓度药剂平板和对照PDA 平板中央，待对照菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率。

1.3.2 混剂毒力测定 根据单剂毒力测定结果，采用菌丝生长速率法，选择作用机制不同、防治效果较好且EC50差异较小的2 种药剂进行混配，测定混剂对马缨杜鹃炭疽病菌的联合毒力。分别设置体积比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 和1∶9 共9 种配比为母液。按照上述方法测定混剂对松针炭疽菌的抑制率,求出毒力回归方程和EC50，参考Sun 等[14]的毒力评判法计算复配农药的共毒系数 (Co-toxicity coefficient，CTC)，评价药剂混用的增效作用。CTC 小于80 为拮抗作用，大于120 为增效作用，80 ～ 120 为相加作用。相关计算公式如下：

1.4 数据分析

采用Excel 2010 进行数据统计处理；使用SPSS 17.0 和DPS 7.05 对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同培养基、温度、pH、氮源、碳源对菌丝生长的影响

试验结果表明，菌丝在5 种培养基上均能生长(图1A)，且5 种培养基对菌丝的生长影响差异显著。在PSA 培养基上生长最快，平均菌落直径为7.60 cm，显著高于其他处理；其次是PDA 培养基，平均菌落直径为7.05 cm。病原菌在OMA、Czapek、GSA 培养基上均能生长，但生长较为缓慢且菌丝极其稀疏，不适宜该菌的培养。

图1 不同培养基(A)、温度(B)和pH(C)对马缨杜鹃炭疽病菌菌丝生长的影响Fig.1 Effects of different culture medium,temperature and pH on mycelial growth of Colletotrichum fioriniae on Rhododendron delavayi

由图1B 可知，病原菌在10～35 ℃均可生长，在15～25 ℃生长较好，且最适生长温度为25 ℃，与其他温度处理有明显差异(P< 0.05)，平均菌落直径为7.05 cm。温度为10 或35 ℃时生长较缓慢，3 d后才开始生长，平均菌落直径分别为4.21 和2.69 cm。在5、40 ℃温度条件下，病原菌菌丝未生长。

由图1C 可知，该菌在pH 为5～11 的范围内均可正常生长，且随着pH 的增大，菌丝生长愈发致密。pH 7～9 长势较好，其中最适pH 为8，平均菌落直径达到8.04 cm，显著高于其他处理。

如表1所示，病原菌在不同的碳、氮源培养基上均可生长。在葡萄糖和可溶性淀粉为碳源的培养基上长势最好，平均菌落直径分别为(5.72±0.15)和(5.59±0.02) cm，显著高于对照的(3.49±0.16) cm以及其他3 种不同碳源的。在乳糖为碳源的培养基上长势最差，平均菌落直径为(3.05±0.24) cm，显著低于其他处理的。氮源以蛋白胨最好，平均菌落直径为(7.63±0.12) cm，显著高于其他氮源培养基的，其次是硝酸钾，平均菌落直径为(6.08±0.26) cm。在以硫酸铵为氮源的培养基上长势最差，平均菌落直径为(1.75±0.39) cm，显著低于其他处理及对照的。由此表明，供试的5 种碳源和氮源中，最适宜病原菌菌丝生长的碳源为葡萄糖和可溶性淀粉，最适宜的氮源为蛋白胨。

表1 碳、氮源对马缨杜鹃炭疽病菌菌丝生长的影响1)Table 1 Effects of carbon and nitrogen sources on mycelial growth of Colletotrichum fioriniae on Rhododendron delavayi

2.2 杀菌剂室内毒力测定

供试的10 种杀菌剂对病原菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用，EC50如表2所示。化学药剂中，肟菌·戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑和丙环唑抑制效果最好，EC50分别为0.102、0.118、1.202 和2.101mg/L。二氰蒽醌和溴菌腈的抑菌活性最低，EC50分别为196.501 和95.402 mg/L。生物农药中，四霉素抑菌效果最好，EC50为1.107 mg/L，其次是蛇床子素，EC50为6.803 mg/L。乙蒜素和宁南霉素抑菌效果相对较差，EC50分别为82.711 和64.712 mg/L。

表2 10 种杀菌剂对马缨杜鹃炭疽病菌的抑菌活性Table 2 Antibiotic activities of 10 fungicides to Colletotrichum fioriniae on Rhododendron delavayi

根据单剂毒力测定结果，选择抑菌效果较好、作用机制不同且EC50相近的10.0%(w) 苯醚甲环唑和0.3% (w)四霉素按照体积比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 和1∶9 进行混配后测定其EC50、CTC 及联合毒力，结果(表3)表明，9 种配比组合的EC50均较小，且小于2 种单剂的EC50，说明以这9 种配比组合进行混配均对马缨杜鹃炭疽病菌菌丝生长具有较强的抑制作用；9 种配比组合的CTC 分别为302.51、511.49、584.56、549.23、423.58、339.93、314.25、326.69 和279.91，均大于120。其中，配比为8∶2、7∶3、6∶4 时CTC 均大于500，表现为显著增效作用，且9 种比例中7∶3 配比EC50最小，为0.193 0 mg/L，CTC 最大(584.56)，为室内毒力测定最佳混剂配比。

表3 四霉素与苯醚甲环唑不同配比混剂对马缨杜鹃炭疽病菌的毒力Table 3 Bioactivities of mixtures containing different ratios of tetramycin and difenoconazole against Colletotrichum fioriniae on Rhododendron delavayi

3 结论与讨论

明确病原菌生物学特性是了解病害发生规律的前提，本研究通过测定马缨杜鹃炭疽病菌生物学特性发现，该菌在pH 5～11 均可生长，最适pH 为8；菌丝对温度适应范围较广，10～35 ℃均可生长，最适温度为25 ℃。这与Baroncelli 等[15]报道的红花炭疽病菌C.chrysanthemi和张琳等[16]报道的南瓜炭疽病菌C.brevisporum生物学特性研究结果相似。供试的5 种碳源中，以葡萄糖为碳源的培养基最适宜该菌的生长，而以乳糖为碳源的培养基明显不利于该菌生长，这与黄蔚等[17]报道的西瓜新炭疽病菌C.gloesporioides研究结果相同。供试的5 种氮源中，菌株在以蛋白胨作氮源的培养基上的生长显著优于其他氮源，而以硫酸铵作为氮源时菌株菌丝生长速率显著低于其他氮源，说明蛋白胨为该菌生长最佳氮源，硫酸铵则不适合作为培养该菌的氮源。此研究结果与曹尚等[18]对高粱炭疽病菌C.sublineola生物学特性测定结果一致。

目前，化学防治仍是田间病害防治的主要手段，对化学药剂进行筛选是植物病害防治的重要内容。宋慧云等[19]对宫粉羊蹄甲炭疽病菌C.gloeosporioides进行室内毒力测定，结果表明98% (w)溴菌腈和97% (w) 吡唑醚菌酯对宫粉羊蹄甲炭疽病菌菌丝生长具有较强的抑制作用。冉飞等[20]对百香果炭疽病菌C.karstii进行室内杀菌试验发现75% (w) 肟菌·戊唑醇和25% (w) 吡唑醚菌酯抑菌效果最好，EC50分别为0.067 和0.463 mg/L。孟珂等[21]对9 种薄壳山核桃炭疽病病原菌的毒力测定结果表明，戊唑醇对C.fioriniae、C.liaoningense和C.tamarilloi等炭疽菌生长具有较强抑制作用，平均EC50为0.49 mg/L。本研究也表明，75% (w) 肟菌 · 戊唑醇和25.0% (w) 吡唑醚菌酯对马缨杜鹃炭疽病菌抑制效果较好，EC50分别为0.102 和0.118 mg/L。试验还发现10.0% (w) 苯醚甲环唑和50.0% (w) 丙环唑ME 对该病原菌也具有较好抑制效果，EC50分别为1.202 和2.101mg/L。另外，生物农药0.3% (w)四霉素和1.0% (w) 蛇床子素对该菌也有较好抑制作用，EC50分别为1.107和6.803 mg/L，以上药剂均可作为田间防治马缨杜鹃炭疽病的候选药剂。

苯醚甲环唑是三唑类广谱杀菌剂，通过抑制麦角甾醇的生物合成、破坏细胞膜结构功能，从而达到杀菌效果[22]。四霉素为不吸水链霉菌梧州亚种的发酵代谢产物，其有效成分可通过抑制菌丝体生长、诱导植物抗性并促进作物生长而达到防治病害的目的[23]。王晓琳等[24]测定了0.3% (w) 四霉素与30%丙硫菌唑对草莓炭疽病菌C.gloeosporioides的室内毒力，结果表明四霉素与丙硫菌唑质量比为1∶15 时抑菌效果最佳，EC50仅为0.022 4 mg/L，增效系数为1.73。韦薇等[25]测定95% (w) 苯醚甲环唑和90% (w) 代森锰锌不同比例复配对柑桔炭疽病菌C.gloeosporioides的影响，结果表明前者与后者1∶7 体积配比时CTC 达到最大(150.25)，是防治该病原菌的最佳配比。贤小勇等[26]测定98% (w)吡唑醚菌酯和96% (w) 苯醚甲环唑不同配比混剂对核桃炭疽病菌C.gloeosporioides菌丝生长的影响，发现2 种药剂按质量比3∶2 和1∶1 进行复配时，毒力均表现增效作用。本研究前期单剂毒力测定结果表明10.0% (w) 苯醚甲环唑和0.3% (w) 四霉素对马缨杜鹃炭疽病菌均有较好抑制作用，为延缓病原菌抗药性、减少化学农药的使用量，故选择这2 种不同作用机理的药剂进行复配以增强防治效果。结果表明，较单剂而言，试验所设置的9 种复配比例均有增效作用，以7∶3 为最佳混剂体积比，EC50最小，CTC 最大。

综合分析认为，75.0% (w) 肟菌·戊唑醇、25.0%(w) 吡唑醚菌酯、50.0% (w) 丙环唑、0.3% (w) 四霉素和10.0% (w) 苯醚甲环唑可作为马缨杜鹃炭疽病的候选防治单剂；将0.3% (w) 四霉素与10.0% (w)苯醚甲环唑进行复配能显著增效。本研究可为百里杜鹃自然保护区马缨杜鹃炭疽病田间药剂筛选及合适的施用浓度提供理论依据，为延缓该地区马缨杜鹃炭疽病病菌抗药性，选择适宜复配药剂提供一定参考。