东方蜜蜂微孢子虫染色体结构维持(SMC)蛋白的分子特性与系统进化分析

钱加珺 ，张文德，张佳欣，赵 萧，赵浩东，高旭泽，朱乐冉，陈大福，付中民，郭 睿

(福建农林大学 动物科学学院(蜂学学院)/福建省蜂疗研究所,福建 福州 350002)

东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae是一种专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞的单细胞真菌病原，对蜂王、工蜂、雄蜂和幼虫均有感染性[1]。东方蜜蜂微孢子虫侵染能引起蜜蜂中肠上皮细胞结构破坏、细胞凋亡和免疫应答抑制，哺育力下降，寿命缩短，严重影响蜂群群势和生产力[2]。目前，东方蜜蜂微孢子虫的参考基因组[3]和全长转录组[4]均已公布，为深入开展相关分子生物学研究奠定了基础。

染色体结构维持(Structural maintenance of chromosome，SMC)蛋白在细菌、古生菌和真核生物中广泛存在，可直接参与染色体的形成与结构维持等动态变化及DNA 的复制、重组和修复等过程，因而对染色质结构的组织、细胞分裂过程中遗传物质的准确分离等均具有关键作用[5]。在水稻中，SMC1和SMC3-1基因被证实参与DNA 双链断裂损伤修复和有丝分裂等生物学过程[6]。作为SMC 复合体蛋白的成员之一，凝聚蛋白复合体Ⅰ通过分级折叠启动早期的染色质凝聚，起到塑造、稳定染色体的作用[7]。敲除凝聚蛋白复合体Ⅰ或Ⅱ的特异亚基均能引起中期染色体结构的明显异常[8]。然而对于东方蜜蜂微孢子虫，SMC 相关研究至今依然缺失。

近期，笔者团队测定了nce-miR-15325 及其靶向的核凝聚复合体亚基(Nuclear condensin complex subunit，NCCS)基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中的表达谱，并发现nce-miR-15325 与NCCS具有相似的表达规律。本研究利用生物信息学方法解析东方蜜蜂微孢子虫NCCS编码的SMC 的分子特性，预测和分析东方蜜蜂微孢子虫和其他物种SMC 的保守基序和结构域，并进行系统进化分析，以期丰富东方蜜蜂微孢子虫SMC的基础信息，并为深入开展相关功能研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 SMC 的分子特性分析

根据前期基于东方蜜蜂微孢子虫转录组数据[9]预测出的NCCS序列，利用NCBI 网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的ORF 工具预测相应的氨基酸序列。通过Expasy 网站(https://www.espasy.org/resources)上的Protparam、ProtScale 和SWISS-model 等软件分析SMC 的理化性质、亲水性和三级结构。使用SignalP 4.1 Server、NetPhos 3.1 Server、TMHMM 及SOPMA 等软件[10]预测SMC 的信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域和二级结构。采用PSORTⅡ软件(https://www.genscript.com/psort.html)[11]进行SMC 的亚细胞定位预测。

1.2 SMC 的保守基序和结构域预测

使用MEME 软件(https://meme-suite.org/)[12]预测东方蜜蜂微孢子虫、海伦脑炎微孢子虫

1.3 SMC 蛋白的系统进化分析

Encephalitozoon hellem、菲尼斯毕罗酵母Piromycescfinnis、发廯菌Trichophytontonsurans和黑曲霉Aspergillusmelleus等10 个物种SMC 的保守基序。通过Pfam 网站(http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)查找东方蜜蜂微孢子虫等10 个物种SMC 保守结构域相关信息。采用TBtools 软件预测上述10 个物种SMC 的结构域，选择默认参数。

利用Blast 工具将东方蜜蜂微孢子虫SMC 氨基酸序列比对到NCBI GenBank 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，搜索序列相似性较高的其他物种的SMC。通过Mega 11.0 软件[13]对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的SMC 进行氨基酸序列多重比对，采用邻接法构建基于SMC 的系统进化树，选择软件默认参数。

2 结果与分析

2.1 SMC 的分子特性

东方蜜蜂微孢子虫NCCS含有3 093 个核苷酸，编码的SMC 含有1 102 个氨基酸。SMC 的分子式为C5 787H9 418N1 526O1 771S41，相对分子质量约130 020，等电点为8.28；包含195 个负电荷氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸分别有67 和128 个；包含202 个正电荷氨基酸，其中赖氨酸和精氨酸分别有169 和33 个；含量最高和最低的氨基酸分别为赖氨酸和色氨酸(表1)。

表1 东方蜜蜂微孢子虫SMC 的氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of SMC in Nosema ceranae

SMC 的脂溶系数为93.49，平均亲水系数为-0.740，亲水氨基酸数量比疏水氨基酸多(图1A)，说明该蛋白为亲水性蛋白。SMC 中不存在典型的信号肽，说明其为胞内蛋白(图1B)。另外，在SMC中预测到104 个磷酸化位点，包含50 个丝氨酸、26 个酪氨酸和28 个苏氨酸磷酸化位点(图1C)。

二级结构分析结果显示，SMC 含有787 个(71.42%)α-螺旋，106 条(9.62%)β-折叠，49 个(4.45%)β-转角和160 个(14.52%) 无规则卷曲(图2A)。三级结构分析结果显示，SMC 的模板为6yvu.1.B，序列相似性为31.26%，其中61.00%的残基自信度达80%以上(图2B)。此外，SMC 同时定位于细胞核、细胞质和线粒体，占比分别为78.30%、8.70%和13.00%。

2.2 SMC 的保守基序与结构域分析

在东方蜜蜂微孢子虫SMC 中预测到9 个保守基序，分别为Motif 1、2、3、4、5、6、7、8、9；类似地，在海伦脑炎微孢子虫、颗粒病微孢子虫Nosema granulosis、麦格水蚤汉氏孢虫Hamiltosporidium magnivora、康氏泰罗汉孢虫Thelohaniacontejeani、菲尼斯毕罗酵母、指间毛廯菌Trichophyton interdigitale、紫色毛廯菌Trichophytonviolaceum、发廯菌和黑曲霉的SMC 中同样预测上述9 个Motif(图3)，说明SMC 在东方蜜蜂微孢子虫和其他真菌物种中高度保守。

图3 东方蜜蜂微孢子虫和其他9 个物种SMC 包含的保守基序Fig.3 Conserved motifs included in SMC of Nosema ceranae and other nine species

在东方蜜蜂微孢子虫SMC 中预测到4 个结构域，包括1 个SMC_N、1 个SMC_hinge、1 个AAA_29 和1 个AAA_23；在海伦脑炎微孢子虫、指间毛廯菌和黑曲霉SMC 中同样预测到1 个SMC_N、1 个SMC_hinge、1 个AAA_23 和1 个AAA_21；在颗粒病微孢子虫、麦格水蚤汉氏孢虫TBU02480.1 和康氏泰罗汉孢虫SMC 中预测到2 个相同的结构域，包括1 个SMC_N 和1 个SMC_hinge；在麦格水蚤汉氏孢虫TBU02444.1 SMC 中预测到6 个结构域，包括1 个SMC_N、1 个SMC_hinge、1 个AAA_29、1 个AAA_21、1 个AAA_23 和1 个AAA_15；在菲尼斯毕罗酵母SMC 中预测到5 个结构域，包括1 个SMC_N、1 个SMC_hinge、1 个AAA_29、1 个AAA_21 和1 个AAA_23；在紫色毛廯菌SMC 中预测到3 个结构域，包括1 个SMC_N、1 个SMC_hinge 和1 个AAA_15；在发廯菌SMC 中预测到3 个结构域，包括1 个AAA_21、1 个SMC_N 和1 个SMC_hinge(图4)。进一步分析发现东方蜜蜂微孢子虫和其他9 个物种的SMC 中均含有1 个SMC_N 和1 个SMC_hinge(图4)。以上结果进一步说明SMC 在东方蜜蜂微孢子虫和其他真菌物种中高度保守。

图4 东方蜜蜂微孢子虫和其他9 个物种SMC 的结构域比较Fig.4 Comparison of structural domains within SMC in Nosema ceranae and other nine species

2.3 SMC 的系统进化分析

如表2所示，东方蜜蜂微孢子虫、海伦脑炎微孢子虫、颗粒病微孢子虫、康氏泰罗汉孢虫、菲尼斯毕罗酵母、指间毛廯菌、紫色毛廯菌、发廯菌和黑曲霉均仅含有1 个SMC，而麦格水蚤汉氏孢虫含有2 个SMC。

表2 东方蜜蜂微孢子虫与其他9 个物种的SMC 蛋白概览Table 2 Overview of SMC proteins in Nosema ceranae and other nine species

氨基酸序列多重比对结果显示，东方蜜蜂微孢子虫与菲尼斯毕罗酵母的SMC 序列相似性最高，达到61.96%，其次是与指间毛廯菌、发廯菌、紫色毛廯菌和黑曲霉，SMC 序列相似性均为60.98%，与康氏泰罗汉孢虫的SMC 序列相似性最低(34.73%)。

系统进化分析结果显示，东方蜜蜂微孢子虫、颗粒病微孢子虫、麦格水蚤汉氏孢虫、康氏泰罗汉孢虫和海伦脑炎微孢子虫的SMC 聚为一个大支，而发廯菌、指间毛廯菌、紫色毛廯菌、黑曲霉和菲尼斯毕罗酵母的SMC 聚为一个大支；东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微孢子虫的SMC 聚为一支，且置信度达到99%，说明二者SMC 的进化距离最近(图5)。

图5 邻接法构建基于SMC 的东方蜜蜂微孢子虫与其他9 个物种的系统进化树Fig.5 Phelogenetic tree of Nosema ceranae and other nine species based on SMC by neighbor-joining method

3 结论与讨论

目前，由于缺乏成熟的转基因操作技术体系，东方蜜蜂微孢子虫绝大多数基因功能未明，相关信息匮乏。本研究通过生物信息学手段对东方蜜蜂微孢子虫NCCS基因编码的SMC 进行分子特性解析，结果显示，SMC 的分子式为C5 787H9 418N1 526O1 771S41，包含1 102 个氨基酸，相对分子质量约130 020，等电点为8.28，脂溶系数为93.49，平均亲水系数为-0.740，亲水氨基酸数量多于疏水氨基酸，说明SMC 可能是亲水性蛋白；不含信号肽和跨膜螺旋区，说明SMC 可能为胞内蛋白和非跨膜蛋白。以上结果丰富了东方蜜蜂微孢子虫NCCS基因的基本信息，为进一步开展相关功能研究提供了有价值的参考信息。另外，预测SMC 同时定位于细胞核、细胞质和线粒体，但主要定位于细胞核(占比78.30%)，鉴于染色体主要存在于细胞核，上述结果符合客观实际；但预测到少量SMC 分布于细胞质和线粒体，一方面需要通过分子生物学试验加以验证，另一方面暗示SMC 功能的潜在多样性。

真核生物中存在6 种SMC，这6 种蛋白两两结合形成异二聚体，进而结合其他组分形成复合体，分别为黏结蛋白复合体、凝聚蛋白复合体和SMC5-SMC6 复合体，这些复合体在DNA 修复、重组与复制等方面发挥重要作用[14]。SMC 在进化上较为保守，从微生物到哺乳动物的SMC 蛋白都具有相似的结构[15]。本研究在东方蜜蜂微孢子虫、海伦脑炎微孢子虫、麦格水蚤汉氏孢虫、颗粒病微孢子虫、康氏泰罗汉孢虫、菲尼斯毕罗酵母、指间毛廯菌、紫色毛廯菌、发廯菌和黑曲霉的SMC 中均预测到Motif 1～9 共9 个保守基序；此外，发现东方蜜蜂微孢子虫和上述其他物种的SMC 均含有1 个SMC_N 和1 个SMC_hinge。以上结果表明SMC 在东方蜜蜂微孢子虫和其他真菌中具有高度保守性，推测SMC 在东方蜜蜂微孢子虫和上述其他真菌中发挥类似功能。本研究发现，东方蜜蜂微孢子虫、颗粒病微孢子虫、海伦脑炎微孢子虫、麦格水蚤汉氏孢虫和康氏泰罗汉孢虫的SMC 聚为一个大支，说明这些物种的SMC 亲缘关系较近；东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微孢子虫的SMC 聚为一支，置信度为99 %，说明二者的SMC 进化距离最近。

前人研究发现SMC 的C 端和N 端相互结合形成ATP 酶功能域，因此SMC 蛋白也属于ABC(ATP binding cassette)蛋白家族[16]，ABC 蛋白在东方蜜蜂微孢子虫的生命活动中起到重要作用[17]。因此，推测SMC 在东方蜜蜂微孢子虫中发挥的功能类似于ABC 蛋白。

通过建立东方蜜蜂微孢子虫侵染成年蜜蜂的模式进行东方蜜蜂微孢子虫的基因功能研究已见诸报道[18-19]。我们下一步拟通过体外转录合成NCCS的dsRNA，并通过饲喂法探究东方蜜蜂微孢子虫侵染蜜蜂宿主过程中NCCS的功能。