新疆乌什县绵羊羊蜱蝇巴尔通体检测及gltA 基因分析

宋浩楠，何 波，李思昂，张 柳，李 正，阙泽伟，赵思雨，武军元*

（ 1. 塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300 ；2. 新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔 843300 ； 3. 哈密市伊州区动物疫病预防控制中心，新疆 哈密 839099 ）

羊蜱蝇系统学分类可归纳为昆虫纲、双翅目、虱蝇总科、虱蝇科、蜱蝇属。羊蜱蝇通常寄生于宿主的体表，通过吸取宿主的血液维持自身的生命活动，在吸食血液的同时对宿主的造成不同程度损伤[1]。许多研究表明，羊蜱蝇宿主范围不断扩大，在许多家养动物和自然野生动物以及人身上均有发现，在多地均有相关报道[2]。羊蜱蝇可传播多种病原体，国外已报道如蓝舌病毒[3]、杀雄菌[4]、巴尔通体[5]、立克次体、绵羊无浆体、锥虫[6]等，我国已报道的病原体如巴尔通体、立克次体[7]、绵羊无形体[8]、沃尔巴克氏体、包柔氏螺旋体[9]、不动杆菌、希瓦氏菌等。

我国已有多个省份的多种动物均被检出携带巴尔通体，其中包括云南省[10]、广东省[11]、黑龙江省[12]、新疆维吾尔族自治区[13]等地区的鼠、猫、犬、牛等。近些年，在新疆、西藏、甘肃、四川等地相继报道了在羊蜱蝇中检出巴尔通体。何波[14]在新疆阿克苏库车市、甘肃武威市等地检测到巴尔通体，通过巴尔通体gltA基因鉴定，阳性率为95%（103/108），与已知Bartonella melophagi的同源性介于99.3%~100.0%。周赛赛等[15]在西藏林芝、日喀则、那曲地区绵羊羊蜱蝇首次检测到巴尔通体的存在，鉴定为Bartonella melophagi。向阳等[16]首次在四川省石渠县绵羊羊蜱蝇中检测出Bartonella melophagi。目前新疆地区对羊蜱蝇携带巴尔通体的研究尚不够充分、完整，本研究对新疆乌什县羊蜱蝇感染情况进行检测，分析羊蜱蝇中携带巴尔通体情况和遗传进化关系，为新疆地区巴尔通体的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2022年3月—5月从乌什县采集绵羊体表寄生的羊蜱蝇，共获得羊蜱蝇78只，将所采集的羊蜱蝇分别装于专用的采样管中，做好记录，使其保持存活并带回实验室。

1.2 试剂与仪器

Trans2K® DNAMarker（北京天根生化科技有限公司，BM101）、GelStain核酸染料（北京全式金生物技术有限公司，GS101）、DNase/RNase-Free 去离子水（北京天根生化科技有限公司，RT121）、2×Taq Plus PCR Master Mix（北京天根生化科技有限公司，KT205）、血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，DP304-03）等T100 TMThermal Cycler PCR 仪（Bio-rad 公司）、高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、恒温培养振荡器（天津欧诺仪器股份有限公司）、全自动凝胶成像分析（ProteinSimple 公司）；电热恒温培养箱、数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）等。

1.3 引物设计

通过检索有关论文，参照GenBank中所报道的羊蜱蝇18S rRNA基因序列和巴尔通体gltA基因序列设计以下引物，均由江苏苏州金唯智生物科技有限公司合成，-20 ℃保存，具体引物序列见表1。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.4 试验方法

1.4.1 虫体DNA提取

将所采集的羊蜱蝇样本依次采用90%、70%、50%、30%、10%浓度的酒精溶液以及蒸馏水为梯度，在37 ℃、250 r/min条件下置摇床中依次冲洗30 min，至虫体表面污物、杂质基本洗净。参照中国蝇类以及羊蜱蝇形态学相关文献[17]，使用体视显微镜对所有采集的样本进行足基节、足转节、肛沟、气门板、侧沟、生殖孔、基突、须肢等特征部位进行仔细观察，参照中国蝇类以及羊蜱蝇形态学相关文献，对羊蜱蝇特征性状进行鉴别分析。通过体视显微镜的观察，对羊蜱蝇形态进行拍照记录。

羊蜱蝇经过充分洗涤以及初步形态学鉴定后，放置于1.5 mL EP 管中。具体提取步骤依据DNA 提取试剂盒说明，完成后放置于-20 ℃冰箱保存，作好编号记录。

1.4.2 PCR扩增

用18S rRNA基因引物以及巴尔通体gltA鉴定引物对提取的羊蜱蝇DNA进行PCR扩增。

18S rRNA PCR反应体系（25 µL）：2×Taq PCR Mix酶为13 µL、上游引物18S-F和下游引物18S-R各1 µL、模板DNA 1 µL，剩余部分用ddH2O补足体系，为9 µL。

反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，38个循环；72 ℃总延伸8 min。

巴尔通体gltAPCR 反应体系（25 µL）：2×Taq PCR Mix 酶为13 µL、上游引物gltA-F 和下游引物gltA-R 各1 µL、模板DNA 1 µL，剩余部分用ddH2O 补足体系，为9 µL。

反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃总延伸5 min。

利用PCR 仪，设置好上述反应条件，试验过程严格保持无菌。PCR 反应结束后，取5 μL PCR 反应产物于1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳结束后，凝胶置于全自动凝胶成像分析仪中观察结果，拍照记录。

1.4.3 测序及遗传进化树构建

将PCR 阳性产物，封口、标记、打包，送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。测序结果通过NCBI数据库进行比对，应用MEGA 7.0 软件建立巴尔通体（Bartonella）系统进化树。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果（见图1、图2）

图1 羊蜱蝇背侧Fig.1 Dorsal side of sheep ked

图2 羊蜱蝇腹侧Fig.2 Ventral side of the sheep ked

虱蝇总科包括4个科级阶元，分别是舌蝇科、蛛蝇科、蝠蝇科和虱蝇科。这4个科的蝇类均营皮外寄生生活，在寄主体表吸血，寄主范围广泛（包括猪马牛羊、鸟和蝙蝠等），并且专一性高[18]。目前，我国主要发现是虱蝇科、蝠虱蝇科和蛛虱蝇科，其中虱蝇科又包括马虱蝇属、利虱蝇属和蜱蝇属在内的12属44种。

舌蝇科以外的3个科，身体均为侧扁，便于在寄主体表穿梭，且爪发达，能够牢牢地抓住寄主。虱蝇的身体通常带有皮革质感，大多数种类有翅膀。蛛蝇和蝠蝇都形如蜘蛛，头变得很小，寄生于蝙蝠体表，大多数种类在演化过程中失去了翅膀（除部分蝠蝇外）。

由图1、图2 可知，本研究采集的羊蜱蝇体型适中，无翅呈革质，密被细毛。雄性虫体与雌性虫体略有差异，雌性成虫（5.5 mm）略长于雄性成虫（4.5 mm）。虫体分3 部分，包括头、胸和腹；头部短平阔宽，无单眼，复眼小，触角短，与胸部连接紧密，胸部不分节，包括3 对足，分别为前足、中足、后足，足末端长有强有力的爪。雌性羊蜱蝇腹部略大于雄性，末端呈凹陷状；与雌性相比，雄性末端突出。

2.2 18S rRNA 基因和巴尔通体gltA 基因扩增结果（见图3、图4）

图3 羊蜱蝇18S rRNA的PCR结果Fig.3 PCR results of 18S rRNA of Melophagus ovinus

图4 羊蜱蝇巴尔通体gltA的PCR结果Fig.4 PCR results of gltA of Bartonella of Melophagus ovinus

由图3、图4 可知，通过PCR 扩增羊蜱蝇18S rRNA 基因和巴尔通体gltA基因，在1.2%琼脂糖凝胶电泳，经过紫外线照射并拍摄电泳图，分别在520 bp和379 bp左右得到与预期大小相符核酸片段。

2.3 序列比对与系统进化树构建及分析

将羊蜱蝇18S rRNA基因以及巴尔通体gltA基因测序结果，通过NCBI 数据库进行了Blast 比对，并应用MEGA 7.0软件建立Bartonella系统进化树（见图5）。

图5 Bartonella gltA基因系统进化树Fig.5 Bartonella gltA Phylogenetic tree of genes

由图5可知，所采集的羊蜱蝇中检出的Bartonella和新疆（MG701233）、美国（AY724768）羊蜱蝇中检出的参考序列相似性较高，同源性在98.41%~100.00%，可确定本试验中新疆乌什县所采集的羊蜱蝇中检出的巴尔通体为Bartonella melophagi。

3 讨论

羊蜱蝇作为繁衍至今的一种古老虫体物种[19]，其分布范围随着生态环境改变、人类生存地迁徙、资源贸易活动愈加频繁而越来越广[20]，包括欧洲、非洲西北部、蒙古国等地，但温度更高的热带地区相对不适宜羊蜱蝇存活[21]。目前，非洲、亚洲、澳大利亚和北美洲多数地区也相继报道了羊蜱蝇的存在[22]。巴尔通体于1855 年被首次报道，在1993年重新分类后，已知有13种与人类疾病有关[23]，可导致人类患猫抓病、卡里翁氏病、多发性盆腔骨髓炎、心内膜炎等多种疾病[24]。

绵羊的品种和年龄是羊蜱蝇在宿主体内移行、宿主间传播的重要影响因素。羊蜱蝇以母羊为传播媒介感染羔羊时，以雄性羊蜱蝇更容易被传播，当羔羊不断长大以及母羊哺育时间缩短时，羊蜱蝇的转移数量会下降。此外，羊毛的类型和长度也是决定羊蜱蝇感染的因素之一，羊蜱蝇对羊毛浓密且长的绵羊具有更高的感染率。目前有效的羊蜱蝇防控措施只有综合性的防控方法，有效、全面地杀虫灭鼠和消毒灭菌，严格检疫，扑杀患病、带菌、抗体阳性和隐性感染的动物以清除传染源，防患于未然。

本研究从新疆乌什县采集到羊蜱蝇，并检测到了Bartonella的存在。通过形态学初步鉴定表明，所采集乌什县绵羊体表寄生的虫体为羊蜱蝇。乌什县地处塔里木盆地西北边缘，气候温度适宜羊蜱蝇生长繁衍。随着生态环境改善，各种人为以及非人为活动的影响，羊蜱蝇的生存环境也受到了较大影响[25]。如今，分子生物学分析能够更有效地鉴定种间进化关系[26]，其中18S rRNA 基因序列在蝇类分类学研究中已被广泛应用，且具有高度保守性[27]。通过分析所采集物种18S rRNA 基因序列，可确定其属于羊蜱蝇。此外，本试验检测新疆乌什县羊蜱蝇中BartonellagltA基因，通过序列比对和建树分析，发现同新疆库车市羊蜱蝇中检测到的Bartonella melophagi（MG701233）相似度极高，在进化树上聚为一支。由于乌什县地处南疆，与西藏相距较近，加上新疆、西藏两地绵羊输出量较大，更加大了两地之间通过绵羊携带的羊蜱蝇传播病原的可能性，还需进一步深入研究。

4 结论

本研究采集的物种为羊蜱蝇，运用分子生物学技术阐述了从新疆乌什县采集的羊蜱蝇体内检测出的BartonellagltA基因与GenBank 中所提交的中国新疆库车市的BartonellagltA基因亲缘关系较近，并鉴定为Bartonella melophagi。本研究意在提供新疆本土绵羊羊蜱蝇巴尔通体数据支撑，加强对羊蜱蝇的防治，为了解羊蜱蝇中携带Bartonella病原的种类以及进化关系提供重要的指导意义与参考价值。