Xpert MTB/RIF Ultra 在快速检测结核分枝杆菌和利福平耐药中的应用

王垚 林珍丽 陈新朝 黄明翔

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一种慢性传染病，目前仍然是导致单一传染病死亡的主要原因之一［1］。我国是TB 高负担国家，耐药结核病（Drug Resistant Tuberculosis，DR⁃TB）的控制形势尤其严峻。涂片抗酸染色简便易行，但其敏感度低，漏诊率高；MGIT 960 液体培养法（液体培养）是MTB 病原学检测的金标准，然而获得培养和药敏结果耗时过长［2］，无法满足临床快速诊断TB 并得到可靠药敏结果的需求。

近年，分子生物学检测技术兴起，Xpert 及其二代产品Xpert Ultra 均可快速检测MTB 及其利福平耐药性。已有国外研究表明Xpert Ultra 检出MTB 灵敏度更高，可提高涂阴肺结核的诊断。在TB 低负担国家中，Xpert Ultra 检出MTB 的特异性与Xpert 相当，高达95%［3⁃4］。目前国内尚未有Xpert Ultra 应用于大规模肺结核痰样本量的研究。本文通过对Xpert Ultra、Xpert 与液体培养在痰标本中检测MTB 的结果进行比较，并分析Xpert Ultra、液体药敏和Sanger 测序检测利福平耐药的一致性，初步探讨Xpert Ultra 在临床结核病诊疗中的应用价值。现报道如下。

1 资料和方法

1.1 研究对象

选取2019 年12 月至2020 年5 月福州肺科医院疑似肺结核患者447 例为研究对象，所有研究对象均已签署知情同意书（福州肺科医院伦理委员会批件号：2018⁃008（科研）⁃01）。纳入标准：具有肺结核可疑症状、体征且近6 个月内未使用过抗结核药。临床诊断标准：参考《WS288⁃2017 肺结核诊断》［5］。对Xpert Ultra 结果与临床诊断不符的患者，对其进行6 个月随访，以确认最终临床诊断。临床最终确诊为活动性肺结核234 例，其中男性185 例、女性49 例，平均年龄（49.82±16.49）；非结核分枝杆菌（non⁃tuberculosis mycobacteria，NTM）肺部感染12 例；其他肺部疾病201 例。172 例Xpert Ultra 检出MTB 的患者依据入组前抗结核治疗情况，分为初治患者117 例，复治患者55 例。

1.2 主要仪器和试剂

BACTEC MGIT960 液体培养系统及配套培养、药敏试剂购自美国BD 公司；GeneXpert Dx 检测系统及配套Xpert、Xpert Ultra 检测试剂盒购自美国Cepheid 公司；抗酸染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；结核分枝杆菌抗原MPT64 检测试剂盒购自Standard Diagnostic 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 痰涂片及抗酸染色镜检

留取合格的痰样本：性状一般为干酪痰、血痰或黏液痰，标本量一般在3～5 mL。

痰抗酸染色并镜检：按照《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》［6］中的标准操作程序执行并报告结果。依据镜下抗酸杆菌量进行判读，结果分为阴性（-）和阳性（1+～4+），本研究以1+及以上为涂片阳性。

1.3.2 MGIT960 液体培养

发展文化戏曲事业，是实现中华民族伟大复兴的中国梦的需要。吕剧作为山东文化大观园中的一朵奇葩，是吕剧故乡人的骄傲和自豪。站在新起点，应对新挑战，东营区要象抓经济建设一样重视吕剧文化建设，积极采取对策，跟上时代潮流，加快吕剧文化的传承、宣传、创新和发展，切实做大做强吕剧文化产业，让现代吕剧“唱响山东、走向世界”，全力打响“中国吕剧文化品牌”。在黄蓝经济区建设中，充分发挥黄河口国际马拉松赛、中国（东营）国际石油石化装备与技术展览会、黄河口文化艺术节等节庆平台作用，实现吕剧唱戏搭台，以戏为媒，增强交流，促进吕剧故乡经济繁荣。

严格按照BACTEC MGIT 960 系统操作说明书进行培养。用4%N⁃乙酰⁃L⁃半胱氨酸⁃NaOH 进行处理，将处理后的标本接种于含营养添加剂及抑制剂的MGIT 液体培养管进行液体培养。仪器自动报阳后对培养物进行菌种鉴定。

1.3.3 菌种鉴定

采用免疫法，遵循试剂盒生产商提供的实验步骤，通过检测阳性培养物中MTB 特异抗原MPT64 鉴定菌种。

1.3.4 MGIT960 液体药敏试验

对菌种鉴定为MTB 的菌株采用比例法对四种一线药物链霉素、利福平、异烟肼、乙胺丁醇进行药物敏感性试验，其中利福平的浓度为1.0 μg/mL，由仪器自动判读结果。

1.3.5 Xpert 和Xpert Ultra 检测

根据试剂配套操作说明书，取痰液置于无菌痰杯中，1∶2 加入样本处理液，旋紧杯盖，用力振摇10～20 次，室温下静置15 min，在静置5～10 min 时再次用力振摇10～20 次，使痰充分液化。取2 mL液化后的痰液加入反应盒，将反应盒置于检测模块，仪器开始自动检测，Xpert 检测耗时2 h、Xpert Ultra 检测耗时80 min，检测程序运行结束系统可自动读出MTB 检测结果与利福平耐药结果。

1.3.6rpoB基因序列检测

1.4 统计学处理

使用SPSS 26.0 统计软件进行数据处理及统计分析，计数资料以n（%）表示，行χ2检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 涂片抗酸染色结果

447 例疑似肺结核患者中，阳性79 例，确诊肺结核患者74 例，余下5 例患者最终诊断为NTM 所致肺部感染。

2.2 三种检测方法的阳性率比较

对447 例疑似肺结核患者痰样本分别行液体培养、Xpert Ultra 和Xpert 检测，三种检测方法阳性率比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 三种检测方法阳性率比较［n（%）］Table 1 Comparison of positive rate of three methods［n（%）］

2.3 三种方法检测MTB 患者的效能

在447 例疑似肺结核患者中，以最终确诊结果为参照，用Xpert Ultra、Xpert 和液体培养检测MTB，三种方法敏感度分别为73.50%、68.80%和46.15%，特异度分别为97.2%，98.59%和100%。见表2。

表2 以临床诊断为标准三种检测方法的结果比较Table 2 Comparison of three detection methods based on the clinical diagnosis

2.4 Xpert Ultra 菌量分级与Xpert、液体培养和涂片结果的比较

Xpert 在“微量”和“极低”这两个级别检出率为72.09%（31/43），在“低”、“中”和“高”三个级别的检出率99.22%（128/129），差异有统计学意义（P<0.05）；在“微量”和“极低”的样本中，液体培养的检出率仅为27.90%（12/43）；而在“低”及以上三个级别的样本中，阳性率达66.67%（86/129），差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 Xpert Ultra 各含菌量级别样本同时行Xpert、液体培养法和涂片法的结果分布情况［n（%）］Table 3 The distribution of Xpert Ultra samples with different levels of bacteria detected by Xpert，liquid culture and smear method［n（%）］

2.5 Xpert Ultra 检测利福平耐药性的结果

经液体培养阳性的108 例样本中，Xpert Ultra未检出MTB 的10 例被排除，另有“RIF Resis⁃tance 不明确”5 例也被排除，共93 例样本纳入统计分析。以液体药敏为标准，Xpert Ultra 检出利福平耐药的敏感度为88.89%，阳性预测值为100%，结果与液体药敏高度一致（kappa=0.928）。见表4。

表4 Xpert Ultra 检测利福平耐药性的结果［n（%）］Table 4 The results of Xpert Ultra in detecting rifampicin resistance［n（%）］

2.6 Xpert Ultra 利福平rpoB 基因检测结果

159 例Xpert Ultra 和Xpert 同时检出MTB 的样本中，排除17 例Xpert Ultra 和Xpert 检测结果为“RIF Resistance 不明确”的样本（主要为MTB 检测结果为“极低”和“微量”两个级别），共142 例样本纳入统计。以rpoB基因Sanger 测序结果为金标准，Xpert Ultra 检出利福平耐药30 例，仅2 例未检出，敏感度为93.75%，其与基因测序、Xpert的结果具有高度的一致性，kappa值均达到0.959。见表5。

表5 三种分子检测方法检测利福平rpoB 基因的结果比较［n（%）］Table 5 Comparison of the results of three molecular assays for the detection of the rifampicin rpoB gene［n（%）］

2.7 Sanger 测序检测rpoB 基因突变特征

对液体药敏结果为利福平耐药的菌株和Xpert Ultra 或Xpert 检出利福平耐药的痰液共35例样本进行rpoB基因序列Sanger 测序。rpoB基因突变情况：3 例样本发生了多位点（≧3 个）碱基突变，均为复治患者；有2 名复治患者和1 名初治患者样本发生rpoB基因双位点碱基突变；单位点碱基突变最为常见，共29 例，其中初治患者10 名，复治患者19 名。见表6。

表6 35 株进行基因序列的MTB 菌株rpoB 基因突变位点分布情况［n（%）］Table 6 Distribution of mutation sites of rpoB gene in 35 MTB strains with gene sequences［n（%）］

3 讨论

耐多药结核病（Multidrug Resistant Tuberculo⁃sis，MDR⁃TB）是我国重要的公共卫生问题之一，及早诊治是控制结核病传播的重要措施。MTB分子生物学检测技术已作为肺结核诊断依据之一［5］。Xpert是整合了样本制备、核酸提取、PCR 扩增于一体的实时分子诊断系统，操作便捷，可2 h 内同时完成MTB及其利福平耐药性的检测，被WHO 推荐用于活动性TB/DR⁃TB 的诊断［7］。Xpert Ultra 是基于Xpert的二代检测卡盒，其操作步骤不变，在提高MTB检出敏感度同时缩短检测时间，仅耗时80 min。

本研究结果显示，以临床诊断结果为金标准，Xpert Ultra 检出MTB 敏感度较Xpert 提高约5%，这与Xpert Ultra 和Xpert 比对实验报告一致［8］；在 检出MTB 特异度方面，Xpert Ultra 与Xpert 无差别，与Andama 等［9］的研究观察一致。

Xpert Ultra 利用全封闭巢式多重实时荧光PCR 检测利福平耐药相关rpoB基因的“核心”区域（RRDR）和两个额外的靶基因（IS1081和IS6110）。Xpert Ultra 还将卡盒的DNA 检测体系提高一倍，故其可检出极低浓度或“微量”MTB，检测限低至15.6 CFU/mL［10］。Xpert Ultra 的结果为“极低及微量”级别时，培养法和涂片法阳性率仅分别为27.90%和9.30%，说明在菌量极低时Xpert Ultra 检测远较培养与涂片法检出率高，显示其在检测涂阴肺结核样本的优越性，国外Dorman 等［4］的研究中也得到相似结论。本试验结果显示随Xpert Ultra 检测含菌量级别的升高涂片的阳性率也相应提高。据文献报道当患者检出MTB“中和高”级别应被认为具有高传染性［11⁃12］。因此Xpert Ultra 检测可对患者的传染性起到早期预警作用，避免人际传播。

利福平和异烟肼都是重要的一线抗结核药物，由于大部分对利福平耐药的菌株也对异烟肼耐药［13］，因此，监测利福平耐药性有助于早发现、早隔离、早治疗MDR⁃TB 患者。

Xpert Ultra 检测利福平耐药性与金标准液体药敏法相比具有较高的灵敏度和较好的一致性。然而，有2 例样本液体药敏检出利福平耐药但Xpert Ultra 未检出。这可能是因为这2 例样本菌株的rpoB突变发生在RRDR 外［14］，据报道只有95%的rpoB突变与RRDR 相关［15］。Xpert Ultra、Xpert 和Sanger 的利福平耐药性检测结果高度一致，三种方法检测能力相当，这与之前相关研究报道相符［4，14，16］。

为了解福州地区rpoB突变情况，本试验对35例菌株或痰样本进行rpoB基因序列Sanger 测序，发现碱基点突变最为常见，共34 例，主要分布在507⁃533 位点间的19 个位置，余1 例为碱基插入突变，发生在513 位点（insCAA⁃CGCCAA）。

总之，Xpert Ultra 不仅具备Xpert 准确快速、操作简便的优点，而且大幅提高了荷菌量较低患者的MTB 检出率，在利福平耐药检测方面与液体药敏结果高度一致，可以为结核病早期诊断及治疗提供实验室依据。Xpert Ultra 检测具有对人员操作要求不高、生物安全风险小等优势，适合在各级医疗机构推广。