白藜芦醇/siRNA 胶束复合物的载药和释药性能研究

贾 莉，苗 方，张卫敏，安 芸，董晓辉，马 兰

（菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000）

基聚乙二醇-聚丙交酯-聚组氨酸-（二硫键合）-聚乙烯亚胺（mPEG-b-PLA-PHis-ss-OEI）共聚物，利用OEI 与siRNA 之间的静电作用力，制备并研究了单独包载siRNA 的递送系统[2]。由于共聚物中具有疏水嵌段PLA 和PHis，可包载疏水性中药单体Res 和siRNA 形成胶束复合物MCpH/抗肿瘤治疗中，利用纳米载体共递送药物可实现肿瘤多靶点精准靶向、高渗透性、快速高效的细胞摄取、降低毒副作用，达到协同抗癌作用[1]。然而，联合递送药物的载药和释药性能是共递送药物发挥抗肿瘤治疗作用的前提和关键。本研究前期成功合成了pH 和还原性双响应功能的单甲氧Redox@Res-siRNA。本研究深入研究了MCpH/Redox@Res-siRNA 的载药和释药性能，为其实现共递送药物应用于抗肿瘤治疗研究奠定了坚实的制剂基础。

1 仪器与试药

DL-180 型超声仪（浙江省象山县石浦海天电子仪器厂）；超高速低温离心机（美国贝克曼公司）； FA 1104 电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；TDL-16B 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；微量移液器（美国Thermo 公司）；SPR-DT12A 药物溶出度仪（天津赛普瑞实验设备有限公司）；RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪华仪器厂制造）。

MCpH/Redox@Res-siRNA（ 实 验 室 自制， 批 号20210103）；FAM-siRNA（ 上 海 吉玛 制 药 技 术 有 限 公 司，Sense strand5’-3’：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，5’-3’：ACGUGACACGUUCGGAGAATT)；白藜芦醇（纯度99%，上海阿拉丁试剂有限公司），Amicon®Ultra-4 超滤管（NMWL=50 kD）；透析袋（进口分装，上海绿鸟科技有限公司）；甲醇、乙腈、PBS 缓冲液等试剂（分析纯，国药化学试剂有限公司）。

2 方法

2.1 Res 体外分析方法的建立[3]配制一定浓度的Res、FAM-siRNA 和空白胶束的溶液，以甲醇为空白对照，于200 ～ 800 nm 波长范围内扫描并绘制紫外-可见吸收光谱。Res 在306 nm 波长处有最大吸收，FAM-siRNA 和空白胶束在此处均无吸收，因此确定306 nm 为Res 的检测波长。该方法专属性符合要求。

取Res 适量，精密称定后，配置成浓度约1.0 mg/mL 的Res 甲醇储备液。精密量取Res 甲醇储备液溶液适量，加甲醇溶液配置成系列浓度的Res 标准溶液。紫外分光光度法（检测波长为306 nm）测定系列浓度Res 标准溶液的吸光度值A，绘制吸光度值A-浓度C 标准曲线。取高、中、低浓度的Res 标准溶液各5 份，测定日内和日间精密度。取适量空白胶束和FAM-siRNA 混合溶液，加入适量Res 标准溶液，测定并计算回收率。上述实验均重复3 次。

2.2 FAM-siRNA 体外分析方法的建立[4]取1 OD FAM-siRNA 粉末加入125 μL DEPC 水溶液溶解，配置成FAM-siRNA 储备液。取适量的FAMsiRNA 储备液，用DEPC 水溶液分别配置系列浓度的FAM-siRNA标准溶液。采用荧光分光光度法，选择激发波长（Ex）为480 nm、发射波长（Em）为520 nm，测定各浓度FAM-siRNA 标准溶液的荧光强度F，并绘制荧光强度F-浓度C 标准曲线。取高、中、低浓度的FAM-siRNA 标准溶液各5份，测定日内和日间精密度。取适量空白胶束和Res 混合溶液，加入适量FAM-siRNA 标准溶液，测定并计算回收率。上述实验均重复3 次。

2.3 Res 包封率和载药量测定 采用超速离心法分离 游 离Res，测 定MCpH/Redox@Res-siRNA 的包封率（EE%）和载药量(DL%)。取适量MCpH/Redox@Res-siRNA 溶 液，于12 000 rpm 离心10 min 后，取上清液，过0.22 μm 微孔滤膜。精密吸取该溶液1.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇定容后，按建立的“2.1 Res 体外分析方法”测定吸光度值A，计算Res 浓度，计算得MCpH/Redox@Res-siRNA 中Res 的 量。 另 取1.0 mL MCpH/Redox@Res-siRNA 溶 液，置 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，测定吸光度值A，带入标准曲线计算Res 浓度，得MCpH/Redox@RessiRNA 中Res 的总量，上述实验均重复3 次。

其中：Wtotal 是制备时加入Res 的量，WRes和Wcopolymer 分别为胶束复合物中Res 和共聚物材料的量。

2.4 FAM-siRNA 包封率测定 采用超滤离心法测定MCpH/Redox@Res-siRNA 中siRNA 的包封率。精密吸取1.0 mL MCpH/Redox@Res-siRNA，加至Amicon® Ultra-4 超滤管（NMWL=30 kD）中，于6 000 rpm 离心10 min。精密吸取0.5 mL 管套中所得的滤液，用DEPC 水定容至10 mL，按建立的“2.2 FAM-siRNA 体外分析方法”，测定荧光强度F，并代入标准曲线中计算游离FAM-siRNA 浓度。按下述公式计算FAM-siRNA包封率（Encapsulation Efficiency，EE%）。上述实验均重复3 次。

其中：ntotal 为加入FAM-siRNA 总量，nfree为未包裹入胶束复合物FAM-siRNA 量。

2.5 不同pH 及还原条件下胶束复合物的药物触发释放行为[5]取MCpH/Redox@Res-siRNA 溶液2.0 mL，置于截留分子量为30 000 的透析袋中。采用溶出度测定仪，将透析袋固定在桨上，分别置于pH 7.4、pH 5.5、pH 7.4+20 mM DTT 和pH 5.5+20 mM DTT 的透析介质中（PBS 缓冲溶液，200 mL，37±0.5℃），设置转速1 000 rpm，按照事先设定的时间点取样，同时补充相同温度和体积的新鲜透析介质。按照Res 体外分析方法和FAM-siRNA 体外分析方法测定样品中Res 和FAM siRNA 的含量，计算24 h 药物累计释放量，并绘制累计释放曲线，上述实验均重复3 次。

2.6 统计学处理 采用Excel 软件对数据进行处理和统计学分析，数据均用± s 表示。

3 结果

3.1 Res 体外分析方法的建立 Res 的体外分析标准曲线方程为A=0.124C+0.0622，R2=0.9995，符合分析要求。测定高、中、低浓度的Res 溶液的日内的相对标准偏差，分别为（1.03±0.21）%、（4.95±1.06）%、（10.05±1.11）%；日间的相对标准偏差，分别为（1.05±0.09）%、（5.01±0.05）%、（10.09±1.22）%，日内和日间的精密度均良好，符合方法学要求。取适量空白胶束和FAM-siRNA混合溶液，加入适量Res 标准溶液，测定回收率为（99.5±1.75）%，符合方法学要求。

3.2 FAM-siRNA 体外分析方法的建立 FAMsiRNA 的体外分析标准曲线方程为F=1083.7C-328.59，R2=0.9999，符合分析要求。测定高、中、低浓度的FAM-siRNA 溶液的日内的相对标准偏差，分别为（1.31±0.12）%、（5.35±0.87）%、（13.40±0.98）%；日间的相对标准偏差，分别为（1.32±0.25）%、（5.36±0.95）%、（13.30±1.20）%，日内和日间的精密度均良好，符合方法学要求。取适量空白胶束和Res 混合溶液，加入适量FAMsiRNA 标准溶液，测定回收率为（99.5±1.23）%，符合方法学要求。

3.3 胶束复合物的包封率和载药量 采用超速离心法测定MCpH/Redox@Res-siRNA 中Res 包封率和载药量分别为（92.2±1.74）%、（9.72±1.63）%。采用超滤离心法测定MCpH/Redox@Res-siRNA 的siRNA 包封率为（94.5±1.42）%。

3.4 胶束复合物的释药性能 MCpH/Redox@RessiRNA 中Res 在不同pH 及还原性条件下的累计释放曲线如图1A 所示，pH7.4 生理条件下，无明显的凸释现象，释放曲线平缓。随着pH 降低至5.5，Res 释放速度明显增加，2 h 的累计释放量即达到了（43.8±4.23）%，表明MCpH/Redox@RessiRNA 的Res 释放具有pH 敏感性，pH 降低，释放速度和累积释放量均显著增加。而DTT 还原性条件对胶束复合物中Res 的释放几乎无影响。

图1 MCpH/Redox@Res-siRNA 胶束复合物中Res 和siRNA 在 pH 7.4、pH 5.5、pH 7.4+20 mM DTT 和pH 5.5+20 mM DTT 条件下的累计释放曲线（n=3）

MCpH/Redox@Res-siRNA 中siRNA 在 不 同pH 及还原性条件下的释放行为如图1B 所示。与Res 释放行为不同，siRNA 的释放呈现pH 和还原环境依赖性。在pH 5.5+DTT 环境中，siRNA 累积释放量为（82.5±6.04）%。与正常生理环境（pH 7.4）相比，溶酶体环境（pH 5.5+20mM DTT）可显著提高MCpH/Redox@Res-siRNA 中siRNA 的累积释放。

4 讨论

4.1 MCpH/Redox@Res-siRNA 的载药性能 Res是目前抗肿瘤治疗中极具前景的中药单体，具有抗菌、抗氧化、免疫调节、抗衰老、抗肿瘤等多种药理活性。由于白藜芦醇口服生物利用度和在水中的溶解度均较低，限制其药物的应用[6]。本研究构建的MCpH/Redox@Res-siRNA 具有mPEG为亲水性外壳，PLA-PHis 为疏水性内核的球形结构。疏水性药物Res 可以通过疏水作用包载于胶束内核结构，包封率和载药量均较高。

siRNA 本身非常不稳定，在血液中会被核酸酶降解，另外，siRNA 结构中含有多个磷酸酯键而带有大量的负电荷，很难进入到带负电的细胞膜之内[2]。胶束复合物结构中的PEI 嵌段具有多个亚胺正电荷，可与siRNA 通过静电作用结合，将siRNA 包裹至胶束内部，包封率较高。

4.2 MCpH/Redox@Res-siRNA 的释药性能 胶束复合物用于抗肿瘤药物递送，具有靶向性高、生物利用度高等独特优势[7]。胶束复合物将药物递送至肿瘤细胞的溶酶体内，药物只有在肿瘤细胞的溶酶体环境(pH 4.5～5.5，还原性)中快速释放，才能发挥其抗肿瘤治疗作用。MCpH/Redox@RessiRNA 结构中的PHis 嵌段具有pH 敏感性。在酸性环境中，组氨酸结构质子化造成PHis 嵌段其由疏水-亲水转变，PHis 嵌段由疏水性胶束内核向亲水性胶束外壳迁移[8]，胶束内核结构紊乱，原来由疏水作用力包载至胶束内核的Res，快速释放。与此同时，与聚组氨酸嵌段相连的二硫键暴露，还原性环境致使其断裂，实现siRNA 触发释放。

5 结论

本研究建立了紫外可见分光光度法测定Res和荧光分光光度法测定FAM-siRNA 的体外分析方法，并测定了MCpH/Redox@Res-siRNA 的包载性能。研究结果显示MCpH/Redox@Res-siRNA 包载性能良好，可用于Res 和siRNA 的联合递送。MCpH/Redox@Res-siRNA 中Res 和siRNA 释放行为结果表明，在正常生理条件下，MCpH/Redox@Res-siRNA 能够稳定包载Res 和siRNA，释放速度较慢，而在肿瘤细胞溶酶体环境（酸性，还原性）中，MCpH/Redox@Res-siRNA 能够快速响应低pH 和还原性环境，均可以快速释放Res 和siRNA，MCpH/Redox@Res-siRNA 具有良好的释放性能。本研究为MCpH/Redox@Res-siRNA 用于抗肿瘤治疗，提供了坚实的制剂学基础。