颅内动脉瘤术后中枢神经系统感染患者脑脊液病原菌分布药敏试验及耐药基因分析

祖向阳 冯 森 马 鹏

新乡医学院第三附属医院，河南 新乡 453000

颅内动脉瘤（intracranial aneurysm，IA）指脑动脉管壁因先天缺陷、动脉硬化或炎症等异常膨出，是蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）常见原因，文献报道SAH 发生后致残和致死率可达40%～50%，因此早期诊断和干预对改善IA 患者预后极为重要［1-3］。随着医学发展，血管内介入治疗已逐渐成熟并取代外科夹闭术成为IA 治疗首选方案，可根据病灶位置、形态及供血区域等具体情况合理选择器材和策略，其效果和安全性均已获得普遍认可［4］。中枢神经系统（central nervous system，CNS）感染是IA 患者介入术后常见并发症且治疗难度较大，可对手术效果和患者预后造成不利影响，甚至威胁患者生命安全［5-6］。随着颅脑手术大范围开展和抗生素不合理应用，近年来术后院内感染患者数量快速增加，其中CNS感染发生率达2.1%～10%，因不同地区医疗水平差异而变化［7-9］。植入物污染、术后引流或长期卧床等因素均可引起IA 介入术后CNS 感染，因其可直接导致脑组织炎症和损伤，CNS 感染相较其他院内感染病情进展迅速且相对更为严重，对患者预后造成不利影响［10］。既往研究表明细菌耐药性是影响抗感染治疗效果的重要原因，因此明确细菌耐药性及其作用机制对提升治疗效果极为重要［11］。本研究主要探讨IA术后CNS感染患者脑脊液病原菌分布、耐药性以及抗菌治疗方案，为改善患者预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2020-03—2022-03 新乡医学院第三附属医院的IA介入术后CNS感染患者64例，其中男34 例，女30 例；年龄37～82（63.18±10.24）岁；IA 位置：前循环35 例，后循环29 例；术前Hunt-Hess分级：Ⅰ级19 例，Ⅱ级27 例，Ⅲ级14 例，Ⅳ级4 例。根据2017 年《中国神经外科重症患者感染诊治专家共识》诊断标准［12］，满足以下①～④项者为临床确诊：①患者出现意识障碍和颅内压增高表现，伴神经局灶性功能障碍或全身感染症状、体征；②CT或MRI等影像学检查显示脑组织水肿、脑室扩张或脑膜增厚等异常征象或占位性病变；③血常规示白细胞计数（WBC）＞10×109个/L 或中性粒细胞占比＞80%；④腰椎穿刺检查颅内压＞200 mmH2O（1 mm H2O=0.009 8 kPa），脑脊液呈黄色、浑浊或脓性，脑脊液WBC＞100×106个/L，葡萄糖含量＜2.6 mmol/L 或蛋白含量＞4.5 g/L；⑤细菌培养结果为阳性。纳入标准：①顺利完成IA 介入手术；②满足CNS 感染诊断标准；③年龄≥18岁；④患者及家属知晓本次研究内容并签署同意书。排除标准：①介入术前存在感染或此前6个月内CNS感染史者；②伴免疫功能障碍或此前6个月内接受免疫治疗者；③伴重要器官功能不全者；④合并全身其他部位感染者；⑤伴精神疾病或认知功能障碍者。

1.2 研究方法

1.2.1 仪器和试剂：Mastercycle Gradient PCR扩增仪（德国Eppendorf 公司），电泳级琼脂凝胶（西班牙BioWest Agarose 公司），DYY-6D 电泳仪和QD-9413B凝胶成像分析仪（北京六一仪器厂），BACT/Alert 全自动微生物培养系统（荷兰Organon Teknika 公司），VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪（法国生物梅里埃公司），DW-86L626 型—80 ℃超低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司），ST16R型高速冷冻离心机（美国Thermo Sorvall 公司），Multiskan FC 酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司），LB肉汤（杭州百思生物技术有限公司），DNA Marker（上海生工生物科技有限公司），Easy Taq 酶、10×buffer 和dNTPs（北京全式金生物技术有限公司），M-H 琼脂平板（西班牙OXIOD公司），核酸染色剂（北京Solarbio公司），细菌DNA 提取试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司），金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922 和铜绿假单胞菌ATCC27853 质控菌株（卫生部临床检验中心），引物序列合成（上海生物技术有限公司）。

1.2.2 CNS 感染耐药性分析：患者入院后详细采集病史，完成体格检查、影像学及实验室检查，临床确诊后给予腰大池持续引流，150～250 mL/d，并应用美罗培南联合万古霉素进行经验性抗感染治疗，脑脊液培养明确病原菌后换用敏感抗生素，若培养为阴性则在用药72 h后观察病情变化，好转者保持用药3周，无效者立即更换抗菌药物，至脑脊液检查显示WBC 正常后巩固治疗2 周。病原菌培养方法：采集患者入院第1 天脑脊液并接种于专用瓶内，采用BACT/Alert全自动培养系统在37 ℃环境下进行振摇培养，提示细菌生长时转接种于血琼脂平板，35 ℃培养18～24 h，然后采用VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定仪分析病原菌类型，同时采用K-B 纸片法进行药敏试验，质控菌株分别为金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922 和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2.3 金黄色葡萄球菌耐药基因检测：将菌株采用LB液态培养基在37 ℃条件下摇床培养24 h，采集1.5 mL菌液以12 000 r/min 离心2 min 后去上清，然后加入Buffer BS 500 μL重悬细胞，采用50 μL溶菌酶37 ℃温育60 min，12 000 r/min离心5 min后去除上清，依次加入Buffer GL 180 μL，蛋白酶K 20 μL和核糖核酸酶A 10 μL，56 ℃温育10 min，与Buffer GB和100%乙醇各200 mL充分混匀后以12 000 r/min离心5 min，去除滤液后加入无菌蒸馏水100 μL并室温静置5 min。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测金黄色葡萄球菌van、erm、msr、aac（6＇）/aph（2″）、mec、fem、gyr、par以及emc等常见耐药基因表达情况，所用引物序列及产物长度见表1。PCR 反应体系包括Premix Taa 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板4.0 μL，dNTP 2.0 μL，然后补充双蒸馏水至25 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min，然后于94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环40 次，最后72 ℃延伸10 min并于4 ℃保持。将PCR产物采用琼脂凝胶进行电泳，参数设置为电压110 V，电流100 mA，40 min后进行拍照和分析，与GenBank比对后明确基因型。

1.3 统计学方法数据分析使用SPSS 22.0 统计学软件，计数资料以率（%）形式表示，组间比较采用χ2检验，计量资料采用（±s）表示，2组比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IA 术后CNS 感染者脑脊液病原菌分布64 例CNS 感染患者中58 例脑脊液培养结果阳性，占90.63%，共分离出病原菌58 株，其中革兰阳性菌35株（60.34%），革兰阴性菌23株（39.66%）。见表2。

表2 IA术后CNS感染者脑脊液病原菌分布Table 2 Distribution of pathogenic bacteria in cerebrospinal fluid of patients with CNS infection after IA

2.2 革兰阳性菌常见抗生素耐药性分析药敏试验显示革兰阳性菌中青霉素G、克林霉素、红霉素、苯唑西林和头孢西丁耐药发生率较高，万古霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星和利奈唑胺耐药发生率较低，且凝固酶阴性葡萄球菌和表皮葡萄球菌整体耐药率高于金黄色葡萄球菌。见表3。

表3 革兰阳性菌常见抗菌药物耐药性分析Table 3 Analysis of drug resistance of common antibacterial drugs to Gram-positive bacteria

2.3 革兰阴性菌常见抗生素耐药性分析药敏试验显示革兰阴性菌中阿莫西林、头孢类抗生素、氨曲南和庆大霉素耐药发生率较高，环丙沙星、美罗培南和亚胺培南耐药发生率较低，且肺炎克雷伯菌和鲍氏不动杆菌整体耐药率高于大肠埃希菌。见表4。

表4 革兰阴性菌常见抗生素耐药性分析Table 4 Analysis of drug resistance of common antibiotics to Gram-negative bacteria

2.4 金黄色葡萄球菌耐药基因检测结果20株金黄色葡萄球菌中ermA、ermB、ermC、msrA、msrB、aac（6＇）/aph（2″）、mecA、femB 和gyrA 检出率分别为30.00%、10.00%、45.00%、40.00%、20.00%、30.00%、55.00%、45.00%和20.00%，见表5。与耐药性进行对应分析显示，mecA/femB 与青霉素G 符合率为75.00%，与苯唑西林符合率为85.00%；erm/msr与克林霉素符合率为70.00%，与红霉素符合率为90.00%；aac（6＇）/aph（2″）与庆大霉素符合率为90.00%；gyrA 与左氧氟沙星符合率为85.00%，与环丙沙星符合率为75.00%；mecA与头孢西丁符合率为80.00%。

表5 金黄色葡萄球菌耐药基因检测结果Table 5 Detection results of drug resistance genes in staphylococcus aureus

3 讨论

血管介入治疗是现阶段IA 的主要干预手段，可有效防止瘤体破裂，预防SAH 发生，并改善患者预后，治疗效果已获得学术界普遍认可，但术后CNS感染近年来明显增多［6］。脑脊液培养和药敏试验是确诊CNS 感染的重要参考依据，同时对抗感染治疗也具有良好指导意义，本研究对64例IA介入术后CNS感染患者脑脊液进行培养分析，其中58例结果阳性，阳性率90.63%，共分离出病原菌58 株，革兰阳性菌35 株，占60.34%，检出率从高到低依次为金黄色葡萄球菌20 株（34.48%），凝固酶阴性葡萄球菌7 株（12.07%）和表皮葡萄球菌6 株（10.34%）；革兰阴性菌23 株，占39.66%，包括大肠埃希菌9 株（15.52%），肺炎克雷伯菌7 株（12.07%），鲍曼不动杆菌3 株（5.17%），可见CNS 感染病原菌以革兰阳性菌更常见，与文献［13］报道结果一致，因此经验性抗感染治疗应首选头孢类抗生素或万古霉素等对革兰阳性菌作用较强的药物。

近年来由于抗菌药物不合理应用，细菌耐药性明显增加，常用抗菌药物杀菌效果逐渐降低，而CNS感染病情进展迅速，易引起神经功能损伤，造成后遗症，甚至威胁患者生命安全，及时进行病原学检查和药敏分析可为针对性应用抗菌药物和快速控制感染提供依据［14-16］。本研究药敏试验显示革兰阳性菌中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌和表皮葡萄球菌对青霉素G、对克林霉素、红霉素、苯唑西林和头孢西丁等均表现出较高耐药性，原因可能与术前预防性应用抗感染药物有关，导致CNS 感染的病原菌多为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌。本研究中革兰阳性菌对万古霉素、呋喃妥因、左氧氟沙星和利奈唑胺耐药发生率较低，因此可作为首选抗感染治疗方案。革兰阴性菌中大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍氏不动杆菌对阿莫西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松分、氨曲南和庆大霉素耐药性较高，而对环丙沙星、美罗培南和亚胺培南耐药率相对较低，可见碳青霉烯类抗生素可作为现阶段抗革兰阴性菌感染的首选药物。本研究显示凝固酶阴性葡萄球菌和表皮葡萄球菌整体耐药率高于金黄色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌和鲍氏不动杆菌整体耐药率高于大肠埃希菌，更易表现出多药耐药，与文献［4，17］报道结果相近。因此，可采用多药联合治疗以增强抗感染效果并缩短用药时间，同时严密随访病情并及时调整治疗方案。

携带耐药基因是细菌产生耐药性的重要原因。本研究以金黄色葡萄球菌为样本进行分析，显示耐药基因ermA、ermB、ermC、msrA、msrB、aac（6＇）/aph（2″）、mecA、femB 和gyrA 检出率分别为30.00%、10.00%、45.00%、40.00%、20.00%、30.00%、55.00%、45.00%和20.00%，这与本研究中金黄色葡萄球菌对青霉素G、克林霉素、红霉素、苯唑西林、头孢西丁以及环丙沙星等多种抗生素均具有较高耐药性结果一致，可见金黄色葡萄球菌通常携带多种耐药基因，从而造成多种耐药性。erm基因包括ermA、ermB 和ermC 3种类型，广泛分布于质粒或染色体，通过编码核糖体甲基化酶并诱导23S rRNA 甲基化导致大环内酯类抗生与核糖体结合障碍，从而造成克林霉素和红霉素等相应药物耐药；此外，质粒基因msr可编码外排蛋白并引起对红霉素等14 或15 环大环内酯类抗生素耐药［18～20］。本研究中erm/msr与克林霉素耐药符合率为70.00%，与红霉素耐药符合率为90.00%，证实携带erm/msr可能是造成金黄色葡萄球菌克林霉素和红霉素耐药的主要原因。金黄色葡萄球菌aac（6＇）/aph（2″）基因检出率较高，是造成氨基糖苷类抗生素耐药的重要原因。本研究中检出率30.00%，与无万古霉素耐药菌株的检测结果一致，较CHEN 等［21］报道结果更高，原因可能与不同地区抗生素应用差异有关。mecA 为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌经典耐药基因，通过编码青霉素结合球蛋白2a（PBP2a）竞争性抑制β-内酰胺类抗菌药物的杀菌活性，femB 为金黄色葡萄球菌特异性表达的高度保守性基因，可与mecA 协同作用并引起多种耐药性［22-23］。本研究显示mecA/femB 与青霉素G 符合率为75.00%，与苯唑西林符合率为85.00%，与头孢西丁符合率为80.00%，证实mecA/femB可引起多种抗生素耐药。gyrA基因突变是喹诺酮类抗生素耐药的常见原因，其机制与DNA 促旋酶结构改变有关［24］。本研究中gyrA 与左氧氟沙星和环丙沙星耐药符合率为85.00%和75.00%，但gyrA 检出率仅为20.00%，低于左氧氟沙星和环丙沙星，可见左氧氟沙星和环丙沙星耐药还与其他因素有关。SHENG等［25］研究认为编码拓扑异构酶Ⅳ的parC 基因与左氧氟沙星、莫西沙星以及耐诺沙星均存在密切联系。本研究表明各种抗生素耐药性均与一种或多种耐药基因紧密相关，但由于样本量偏小，且金黄色葡萄球菌与耐药性相关的基因突变较多，因此无法详细阐明各种抗菌药物耐药的所有机制，有待后续研究扩大样本量进行更为深入和细致的分析。

IA 术后CNS 感染病原菌以革兰阳性菌更为常见，且细菌耐药率较高，明确细菌耐药性及相应基因型可为合理选用抗菌药物提供依据，从而提升抗感染治疗效果。