不同部位载药可溶性微针载药量比较及体外评价

钟家浩 姚文栋 谢先泽 徐恒武

可溶性微针（dissolving microneedle，DMN）是一种由可溶性生物相容性材料制成微米级针体，在穿透皮肤角质层（stratum corneum，SC）后溶解释放装封于针体内药物的一种新型给药剂型[1-3]。DMN 刺穿角质层产生微孔道，但其深度不会损伤真皮中的神经末梢和血管[3]。因此，DMN 透皮给药不会导致出血和疼痛，是一种无痛给药方式。尽管在药物递送方面极具开发潜力，但DMN 由于依赖针体透皮给药，其载药局限于针体而使载药量低，限制了其进一步开发及临床应用潜力[4]。课题组前期研究中发现，医用胶布辅助微针给药后背衬层也会溶解吸收[5-6]。因此，本研究以聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）为材料，制备不同部位载不透皮的多肽类药物——神经毒素（neurotoxin，NT）的DMN，并对其形态特征，机械强度，载药量及体外透皮释放进行评价。

1 材料与方法

1.1 仪 器 微针模具，台州薇凯生物科技有限公司；HF-50 数显推拉力计HLX-S 推拉力计测试机架，美国PACK 公司；TL6R 立式低速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；DZF-6050 真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；Waters Alliance e2695型高效液相色谱仪，美国Waters 公司；Nikon Eclipse Ci-L 显微镜，日本尼康株式会社。

1.2 材 料 NT，质量分数＞97%，云南龙凤谷生物药业有限公司，批号H45 021228；PVP，美国Sigma-Aldrich 公司，批号BCBP9635V；CS，上海麦克林生化科技有限公司，批号C11 082605；实验用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

1.3 不同部位载药DMN 的制备 本研究依据前期研究使用两步离心法[5-6]制备DMN（见图1）：（1）DMN针体的制备：以质量比为1∶1 分别称取CS 与PVP 于烧杯中，加入5 mg/mL 的NT 水溶液或纯水0.8 mL，充分溶解并搅拌均匀。将含药的基质液注入微针模具中，在4 ℃条件下，4 000 r/min 离心10 min，除去并收集微针模具表面的含药基质液，放入干燥箱中干燥1 h 后取出备用；（2）DMN 背衬层的制备：以质量比为1∶1 分别称取CS 与PVP 于烧杯中，加入5 mg/mL的NT 水溶液或纯水5.0 mL，搅拌均匀后注入微针模具，相同条件下离心10 min，取出具有含药基质液的微针模具干燥成形，用弯镊小心脱模，即得DMN。

图1 两步离心法制备不同部位载药可溶性微针示意图

1.3.1 针体载药可溶性微针的制备（DMN-A）在“1.3”项下，（1）中使用5 mg/mL 的NT 水溶液溶解CS与PVP；（2）中加入纯水，其余步骤不变，得到针体载药可溶性微针（DMN-A）的制备。

1.6 体外透皮释放 使用Franz 扩散池法做体外透皮释放评价。在Franz 扩散池的接收室内加入pH=7.4 的PBS 作为接收液，超声排出多余空气。取离体大鼠皮肤，角质层朝上。将DMN-A、DMN-B、DMN-C置于离体大鼠皮肤上，按压后用医用胶布固定，过程中保证皮肤完整性。固定供给池和接收室，随后以600 r/min 的转速模拟人体皮下血液和组织液内循环，保持32 ℃恒温。分别于0、10、20、30 min 及1、2、3、4、6、8 h 后收集0.5 mL 接收液作为样品进行含量测定，取样后及时补充等量新鲜接收液。将取出的接收液样品处理并HPLC 测定浓度，计算并绘制药物累积渗透释药曲线。

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1.7 统计学方法 应用IBM SPSS Statistics 26 软件进行数据分析。所有数据经Shapiro-Wilk 检验（适用于n＜50），均符合正态分布，以均数±标准差（）表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。n 表示实验重复次数。

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停工吹扫期间，轻油线的吹扫基本在4月11日至4月12日完成，为了在安全的前提下完成吹扫任务，采取以下较好的措施：

1.3.2 背衬层载药可溶性微针（DMN-B）的制备 在“1.3”项下，（1）中使用纯水溶解CS 与PVP；（2）中加入5 mg/mL 的NT 水溶液，其余步骤不变，得到DMN-B 的制备。

1.3.3 针体与背衬层均载药可溶性微针（DMN-C）的制备 在“1.3”项下，（1）中使用5 mg/mL 的NT 水溶液溶解CS 与PVP；（2）中加入5 mg/mL 的NT 水溶液，其余步骤不变，得到DMN-C 的制备。

1.5 载药量测定 将DMN 溶于1 mL 去离子水中，提取10 min 后，以8 000 r/min 离心，5 min 后取上清液过0.45 μm 微孔滤膜，以前期研究中的色谱条件测定其载药量。

1.4 形态特征及机械强度 将微针裁剪至合适大小置于Nikon Eclipse Ci-L 显微镜下观察形态特征，记录微针长度及宽度。使用HF-50 数显推拉力计测定微针纵向与横向的断裂力以确定DMN-A、DMN-B、DMN-C 的机械强度。

2 结果

2.2 载药量测定 针体载药的DMN-A 载药量最少，为（15.2±0.3）μg；背衬层载药的DMN-B 载药量较DMN-A 显著升高（P＜0.01），达（87.4±2.8）μg；针体与背衬层均载药的DMN-C 载药量较DMN-A 也显著升高（P＜0.01），为（103.7±3.2）μg；表明背衬层载药空间的增加使载药量明显提升。

表1 不同部位载药的DMN 机械强度

图2 不同部位载药可溶性微针1 h 与8 h 透皮释放曲线（n=3）注：DMN-A 是针体载药可溶性微针；DMN-B 为背衬层载药可溶性微针；DMN-C 为针体与背衬层均载药可溶性微针

图2 DMN 正置与侧置下形态特征（比例尺为1000 μm）

2.1 形态特征及机械强度 三种DMN 均由同一批微针模具制备，形态特征一致。如图2 所示，DMN 整体为金字塔形，正置镜头下可见正方形及棱边轮廓，侧置镜头下为三角形。DMN 高度达500 μm，底宽度为300 μm，针体之间间距约为850～900 μm。机械强度如表1 所示，DMN-A、DMN-B、DMN-C 的横向断裂力、纵向断裂力比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 体外透皮释放 体外透皮释放如图3 所示，三种不同的DMN 的释放均呈现缓释状态，但又有明显的差异。针体载药的DMN-A 在三者中释放速度最快，尽管在前期释放较慢（前20 min），但在1 h 已大于60%，且在4 h 已释放90%以上；背衬层载药的DMN-B 在三者中释放速度最缓，0.5 h 仍不足10%，8 h 未达60%，DMN-B 在8 h 仍呈释放趋势；针体与背衬层均载药的DMN-C 释放速度略快于DMN-B，但明显低于DMN-A，8 h 释放70%，在4～8 h 释放速度已有所减缓，但仍呈释放趋势。

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3 讨论

DNM 通过微米级针体穿透角质层，与体液接触后生物相容性材料溶解释放装封在微针中的药物[1-3]。前期研究发现，背衬材料溶解后亦会通过皮肤吸收。因此，本研究制备了不同部位载药的DMN-A、DMNB、DMN-C 并对其进行表征及体外评价。三种不同部位载药的DMN 形态特征一致，均为金字塔形，表明载药对形态无影响。DMN 通过针体穿过SC 释药，需要具备足够的机械强度。前期研究中发现PVP 及CS的复合材料可以增强机械强度，因此选择了两者机械强度比例制备DMN[5]。已有研究表明，金字塔形的微针相比于其他形状微针结构更为稳固[7]，能够更好地穿透SC。所制备的三种微针在机械强度无明显差异，不同部位载药未改变机械强度。

进一步，通过对2017年不同读者实际参与采访工作的程度进行初步分析，得到如图1所示的结果。由图可知，研究生读者对采访工作的参与程度与借阅需求极度不对称（荐购书目册次与借阅册次比值小于0.05）；由于我馆采访模式的设置，教职工对采访工作的参与程度较高；本专科生与全英语实验班的参与程度处于较低水平。

在制备的三种DMN 中DMN-A 的载药量最低，这是因为其只通过微针针体载药，相比于其余两者载药空间最小。尽管载药量较低，在释放时由于针体最先穿过角质层与体液接触，因此，DMN-A 释放速率远高于其余两者，在4 h 已基本释放完全。背衬层载药明显增加了载药空间，DMN-B 载药量约为DMN-A 的5.75 倍。但DMN-B 释放速率最慢，在最初30 min 释放极少，较DMN-A 呈现更明显的缓释趋势[8]。这是由于，DMN-B 需要先溶解进入皮肤的前端针体，然后再释放。由于针体与背衬层均载药，载药空间最大，DMN-C 载药量最高，约为DMN-A 的6.82 倍。在体外透皮释放时，DMN-C 针体溶解后在前期较DMN-B 也有明显释放，背衬层的缓慢释放也较DMN-A 持久。尽管DMN-C 兼具DMN-A 两者特性，但其在6 h 后仍有释放，甚至8 h 依旧未释放完全。而微针在穿透活体动物的角质层后，微孔道在6 h 基本恢复，8 h 恢复完全[8-9]。DMN-B、DMN-C 有部分在背衬层中的药物滞留在角质层外。因此，DMN-C相较DMN-A 虽显著提高了载药量，仍存在优化空间。后续可改进针体及靠近微针的前部背衬层用于载药，而靠后的背衬层部分不载药，调整其比例，使DMN-C 在6 h 内释放完全。