宏基因组测序在实体器官移植术后肺部感染患者中的应用价值初探

姜寒水 鲁尔旦 吴国明 祝 艳 刘晴晴 李宗煜 陆 明

实体器官移植（solid organ transplantation，SOT）技术日趋成熟，SOT 术后受者需长期使用免疫抑制剂来预防和治疗排斥反应，使得细胞免疫和体液免疫功能低下，继发各种病原体感染的风险显著增加，其中以肺部感染最常见[1]。传统病原学检测方法包括病原体培养、抗原抗体检测等，但阳性率不尽理想且耗时较长。宏基因组测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）可通过测定微生物核酸序列，快速、准确、广覆盖地获得样本中病原体群体的基因组信息，已越来越多地应用于临床[2]。本研究对57 例肝移植及肾移植术后发生肺部感染的受者资料进行回顾性分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2018 年6 月至2020 年7 月在树兰（杭州）医院住院治疗的57 例诊断为肺部感染的肝移植和肾移植受者，均行纤维支气管镜检查并采集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），接受mNGS 和传统病原学检测方法的有19 例，为mNGS 组；采用传统病原学检测方法的有38 例，为传统方法组。本研究通过树兰（杭州）医院科研伦理委员会审核（批件号：KY2022063）。

1.2 诊断标准 参照《实体器官器官移植术后感染诊疗技术规范（2019 版）》[3]中，细菌性肺炎的诊断标准。

1.3 纳入及排除标准 纳入标准：SOT 术后符合以下第4 条或前3 条中任何2 条：（1）新近出现的咳嗽咳痰或原有呼吸道疾病加重，并出现脓性痰或脓性气道分泌物，伴或不伴胸痛；（2）发热，体温 ＞38 ℃；（3）外周血白细胞计数＞10×109/L 或＜4×109/L，伴或不伴细胞核左移；（4）影像学检查：胸部影像学检查显示新出现或进展性片状、斑片状浸润性阴影或段实变影，伴或不伴胸腔积液。排除标准：（1）有支气管镜检查禁忌者。（2）肺部病灶由明显非感染性因素导致，如药物相关肺毒性。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 观察指标 收集纳入病例的年龄、性别、移植类型、感染发生时间、确诊时间、病原学结果采信率、住院天数等指标。所有病例均在入院第2 天行纤维支气管镜检查并采集BALF，传统方法组用BALF 进行细菌、真菌、抗酸杆菌涂片及培养等传统病原学检测。mNGS 组行常规传统检测方法同时送检mNGS。

1.4.2 方 法 所有BALF 标本在获取后1 h 内送本院检验科，进行细菌涂片及培养（郑州安图生物，哥伦比亚血琼脂平板，批号20200730B，巧克力琼脂平板，批号20200412B），真菌涂片及培养（郑州安图生物，沙保罗琼脂平板，批号20200527B），结核涂片及培养（结核BactecMGIT960 液体培养基，批号7166829）。呼吸道多项病原体抗原抗体检测采用间接荧光法检测（北京贝尔生物，腺病毒20200411，合胞病毒20200427，肺炎支原体20200517，肺炎衣原体20200421，甲型流感病毒20200421，乙型流感病毒20200421，埃可病毒20201203，柯萨奇病毒20201228，副流感病毒20200112）。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（Gene Xpert MTB/RIF）采用巢式荧光PCR 方法（Gepheid AB，批号1000134732）检测结核分枝杆菌rpoB 基因。六胺银染色检测耶氏肺孢子菌（珠海贝索生物，批号C210901）。mNGS 按TIANamp MicrDNA 试剂盒（华大基因，鄂汉械备20190039 号）步骤提取DNA，超声破碎至200～300 bp 大小片段。使用Agilent 2100 对DNA 文库进行质控，环化后的文库加载到测序芯片，使用BGISEQ-50 进行测序。测序数据过滤掉低质量及小于35 bp 的数据，获得的高质量数据通过BWA网站进行比对，通过匹配到某种病原体的序列数，根据序列数高低及临床其他指标判断可能的病原体。

1.5 统计学方法 应用SPSS 21.0 对数据进行统计分析。定量资料采用SW 检验检测正态性。正态分布的定量资料用均数±标准差（）描述。如方差齐性采用两独立样本t 检验，方差不齐性资料采用近似t检验。非正态分布的定量资料用中位数±（25%分位数，75%分位数）[M±（P25，P75）]描述，两组间比较采用秩和检验。定性资料采用χ2检验，若理论频数T＜5 但T≥1，采用连续性校正的卡方进行检验，如果理论频数T＜1，则用Fisher 确切概率法，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 mNGS 组及传统方法组一般资料比较 mNGS组19 例，其中男15 例，女4 例，中位年龄46（27～67）岁，肝移植病例8 例，肾移植病例11 例，中位肺部感染发生时间为移植术后5（0.5～45）个月。传统方法组38 例，男29 例，女9 例，中位年龄54（16～65）岁，肝移植病例15 例，肾移植病例23 例，中位肺部感染发生时间为移植术后9（1～216）个月。两组间年龄与肺部感染发生时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组间性别及肝肾移植比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。mNGS 组BALF 病原学检出阳性率94.74%（18/19），传统方法组病原学阳性率47.36%（18/38），两组间检出阳性率差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 两组实体器官移植术后肺部感染患者临床资料比较

2.2 mNGS 组及传统方法组检出病原体分布情况分析 两组患者病原学阳性检出共计36 例，其中耶氏肺孢子菌是检出最多的病原体，达到44.4%（16/36），其次为巨细胞病毒，达到27.8%（10/36）。16 例耶氏肺孢子菌病例中有13 例为肾移植患者，仅3 例为肝移植患者。巨细胞病毒也在肾移植患者中更多见。比较mNGS 组和传统方法病原菌的检出情况，可发现巨细胞病毒、人疱疹病毒、流感嗜血杆菌、军团菌通过传统方法难以检测到，而mNGS 则有一定优势。3例结核分枝杆菌均用Gene Xpert MTB/RIF 方法检测到，但由于此3 例患者并未同时送检mNGS，因此无法得知其对结核分枝杆菌检测的可靠性。

mNGS 组19 例患者中，mNGS 检测阳性为18例，而传统检测方法阳性仅为5 例。除了耶氏肺孢子菌、巨细胞病毒及军团菌这类难以通过传统培养方法检测出的特殊病原体之外，曲霉菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌等这类易于被传统培养方法检出的病原体通过mNGS 检出8 例，仅1 例细菌培养为肺炎克雷伯杆菌，其mNGS 结果也与之相符。由此可见mNGS 在常见细菌、真菌检出率方面的优势也远胜传统培养方法。同时还可看出传统方法组检测出的5例阳性病例结果与mNGS 组符合率为100.0%（见表2）。mNGS 组中单一检测到病原体仅4 例（4/18），分别为肺炎克雷伯杆菌1 例、耶氏肺孢子菌1 例、军团菌1 例、巨细胞病毒1 例；而混合感染的有14 例（14/18）。

表2 19 例mNGS 组实体器官移植术后肺部感染患者病原体检出情况（例）

3 讨论

SOT 患者由于术后应用大剂量免疫抑制剂导致免疫力水平低下，加之肺脏自身的特殊解剖结构，例如属于开放性器官，病原体容易侵犯下呼吸道，多种因素造成肺部感染发生率远高于其他器官感染。SOT受者肺部感染的程度往往比较严重，一旦发生感染，病情进展迅速，也容易并发腹腔内感染甚至血流感染，且病死率高[3]。因而早期识别感染病原体可优化抗感染治疗方案，缩短住院天数，改善生存率[4-5]。

mNGS 直接从样品中提取基因组DNA 后进行测序分析，将所测序列与专业数据库比对，得出样本中所含物种的信息，通过严格的宏基因组拼接，可获得较长的DNA 片段，若测序达到一定的通量，可直接获得一个或多个病原体基因组草图，在此基础上进行功能分析及病原体群落结构和多样性分析，可更准确地反映病原体生存的真实状态[6]。Huang 等[7]对240 例可疑肺部感染患者的BALF 进行mNGS 及传统病原学方法检测，mNGS 检测敏感性88.30%，特异性为81.16%，传统方法分别为25.73%及88.41%，体现出mNGS 在病原体检测上有高灵敏性的巨大优势。本研究回顾性病例分析2018 年6 月至2020 年7月在树兰（杭州）医院住院治疗的57 例诊断为肺部感染的肝移植和肾移植受者，采集BALF 进行mNGS及传统病原学检测方法进行检测。mNGS 组病原学检出率为94.74%，而传统方法组仅为47.36%，这与陆瀚澜等[8]在34 例SOT 术后肺部感染受者中的研究结果相似，mNGS 组病原学检测阳性率为92.3%，高于传统方法组的55.6%。

SOT 患者应用抗排异药导致免疫功能低下，使得肺部感染的病原体谱发生改变[9]。与陆瀚澜等[8]研究结果相似，本研究中SOT 合并肺部感染的受者病原体检测到最多的也是耶氏肺孢子菌，其次为巨细胞病毒、人疱疹病毒、曲霉菌、结核分枝杆菌。尤其是本研究中肾移植患者耶氏肺孢子菌感染率明显高于肝移植患者，这也提示耶氏肺孢子菌感染与免疫抑制水平相关，因为肾移植患者需要更大剂量的免疫抑制剂。

综上所述，本研究中SOT 受者肺部感染病原学检测阳性率方面，mNGS 技术高于传统检测方法，且缩短确诊时间，对于耶氏肺孢子菌、巨细胞病毒等特殊病原体检测有较大优势，显示其在SOT 受者肺部感染诊断中的良好应用前景，但也存在一定的局限性，例如背景菌的掺杂、对胞内菌及厚壁微生物检出率低、特异性不足等[10-11]。