婴幼儿配方食品（乳粉）中牛磺酸样品前处理方案的研究（HPLC-柱前衍生法）

王树奇 吉利利 解鸿蕾

作为一种对视网膜、心肌、肠、胃、肺和肝脏起到保护作用的特殊氨基酸，牛磺酸在提高人体免疫力等方面具有重要作用，在婴幼儿神经中枢和大脑发育方面也能起到一定的促进作用。目前针对婴幼儿配方食品（乳粉）中牛磺酸的检测主要采用的是仪器分析法。其中，氨基酸分析仪测定法具有选择性好、灵敏度高和稳定强等优点，但测定使用的仪器售价较高且分析时间较长；薄层色谱法和酸碱滴定法具有实验成本较为低廉等优点，但灵敏度较低，很难实现精准测量。本文在国标方法（GB 5009.169-2016）第二法的基础上，对前处理过程进行了讨论，得到了优化后可用于日常检测工作的方法。

一、材料与设备

1.标准品和试剂。牛磺酸（色谱纯），天津科密欧；盐酸甲胺（色谱纯），上海易恩化学技术有限公司；丹磺酰氯（色谱纯），上海安谱；乙腈（色谱纯），美国Fisher；亚铁氰化钾（分析纯），天津科密欧；乙酸锌（分析纯），天津科密欧。

2.仪器与设备。LC-20A液相色谱仪，日本SHIMADZU公司；C18色谱柱（5?m，4.6×250mm），纳谱分析技术有限公司；VORTEX 3涡旋振荡器，德国IKA公司；SQP电子天平，德国Sartorius公司。

二、实验与方法

1.标准溶液及试剂的配制。（1）牛磺酸标准储备溶液（0.5mg·mL-1）的配制。称量约25mg牛磺酸标准物质于50mL烧杯中，加入约20mL水溶解后转移至50mL棕色容量瓶中，用水定容。

（2）试剂的配制。①丹磺酰氯溶液：称取0.150g丹磺酰氯于100mL容量瓶中，用乙腈定容；②盐酸甲胺溶液：称取0.5g盐酸甲胺于25mL容量瓶中，用水溶解定容；③乙酸钠缓冲液：称取8.44g乙酸钠于1000mL容量瓶中，用水溶解定容，经0.45?m微孔滤膜过滤；④乙酸锌溶液：称取15.0g乙酸锌于50mL容量瓶中，用水定容；⑤亚铁氰化钾溶液：称取7.5g亚铁氰化钾于50mL容量瓶中，用水定容。

2.样品的提取。称取经均匀具有代表性的样品2.5g于50mL塑料离心管中，加入40mL（45℃）水将样品溶解后，再加入蛋白沉降剂（亚铁氰化钾和乙酸锌溶液）各0.5mL定容至25mL刻度线，在振荡器上振荡5min后，经离心（5000r/min离心5min）后取上清溶液过滤待用。

3.衍生。取1mL滤液于50mL塑料离心管中，加入碳酸钠缓冲溶液和丹磺酰氯溶液各1mL，涡旋2min后放入37℃气浴恒温培养箱，120min后快速加入0.1mL盐酸甲胺溶液于离心管中终止反应。

4.牛磺酸标准溶液的制备。吸取适当的牛磺酸标准中间液，相当于0?g·mL-1、0.5?g·mL-1、2.0?g·mL-1、5.0?g·mL-1、10.0?g·mL-1、20.0?g·mL-1和50.0?g·mL-1的牛磺酸上机工作液，其他操作步骤同实验方法中的衍生步骤。

5.仪器条件。液相色谱仪：岛津LC-20A；进样量：20?L；色谱柱信息：C18色谱柱（5?m，4.6×250mm），纳谱分析技术有限公司；柱流量：1.0mL·min-1；柱温：35℃；洗脱程序：等度洗脱（乙酸钠溶液：乙腈=7：3，用冰乙酸调节pH为4.4）；检测波长（荧光检测器）：Ex-330nm，Em-530nm。

三、结果与分析

1.样品前处理方式的优化。加入沉淀剂亚铁氰化钾和乙酸锌溶液定容至50mL，其他操作步骤同实验方法。由表1可知，在沉淀剂为0.5mL时，样品衍生溶液呈现澄清状态且峰面积响应值较高，故加入各0.5mL的亚铁氰化钾和乙酸锌溶液。

设定不同的提取溶液和乙酰氯溶液比例，其他操作步骤同实验方法。由表2可知，提取溶液和乙酰氯溶液的比例为1：1时，样品衍生溶液呈现澄清状态且单位峰面积响应值较高，故最终选取提取溶液和乙酰氯的比例为1：1。

设定不同的碳酸钠溶液使用量，其他操作步骤同实验方法。由表3可知，当加入1.00mL碳酸钠溶液时，样品衍生溶液的状态为无絮状物沉淀且峰面积响应值达到饱和，故最终选取1.0mL的碳酸钠试剂使用量。

设定不同的衍生时间，其他操作步骤同实验方法。由表4可知，当衍生时间为60min，样品响应值达到饱和，但是该样品有颜色，长时间的话容易对色谱柱产生影响，故选择衍生时间为120min。

在不同的衍生温度下衍生120min，其他操作步骤同实验方法。由表5可知，在25℃条件下衍生120min，样品响应值达到饱和，但是该样品有颜色，本着保护色谱柱的原则，最终选择在37℃条件下衍生120min。

2.方法学验证。（1）检出限、定量限与线性方程。经过对牛磺酸对照品色谱图的研究与分析，最终以牛磺酸对照品检测的浓度（μg/mL）为横坐标，以牛磺酸对照品检测的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，经计算得到线性回归方程：y=467556x+134103，其相关系数为R2=0.9997，线性范围为0-50?g·mL-1。通过对牛磺酸的质量浓度经3倍和10倍的信噪比计算，得到优化方法的检出限为0.05mg/100g，定量限为0.1mg/100g。

（2）優化方法与国标方法的精密度比对。选取某品牌的奶粉，通过优化后的方法和国标方法的比对发现，在重复6次的前提下，优化后的方法和国标方法的检测平均值分别为40.7mg/100g和40.5mg/100g。国标方法的RSDs为3.17%，本方法的RSDs为3.55%，两个方法的RSDs为0.38%，说明优化后的方法和国标方法的检测数值没有明显区别。具体数据详见表6。

（3）实验的准确度。对某品牌的奶粉进行加标回收验证实验，在20倍检出限（1.0mg/100g）、5倍定量限（5mg/100g）和10倍定量限（10mg/100g）三个水平，每个水平进行6次加标回收验证实验，三个水平的加标回收率依次为101.7%、95.3%和95.1%，相对标准偏差为6.39%-7.75%。

综上所述，本方法对国标方法（GB 5009.169-2016第二法）的样品预处理过程进行了深入研究和探讨，该方法的回收率为95.1%-101.7%，RSDs（n=6）为3.55%，方法检出限为0.05mg/100g，定量限为0.1mg/100g。通过对前处理过程的优化，降低了无机试剂和耗材的使用，具有较高的检测效率、较低的检测成本和较好的灵敏度等优点，能够满足日常检测需求。

作者简介：王树奇（1985-），男，黑龙江哈尔滨人，工程师，硕士研究生，研究方向为食品（乳品）安全与检测方法。

吉利利（1987-），女，天津人，项目经理，硕士研究生，研究方向为食品（乳品）营养与安全。

解鸿蕾（1989-），女，黑龙江哈尔滨人，工程师，硕士研究生，研究方向为食品工程。