QuECHERS结合LC-MS/MS检测动物源食品中的9种β-受体激动剂

王苏乐 海娜

β-受体激动剂是一类动物兴奋剂，具有促进蛋白质合成、加速脂肪分解等生理作用，但却会严重影响畜产品质量安全，食用β-受体激动剂污染的食物可能会引起食物中毒，甚至侵害人体的心血管及神经系统。因此，β-受体激动剂残留检测十分重要。

β-受体激动剂的检测手段多样，常见方法包括免疫分析法、毛细管电泳法、液相色谱法、气相色谱串联质谱法、液相色谱串联质谱法等。其中，免疫分析法检测快速、操作简便，但其结果假阳性率高；毛细管电泳法操作简单，但分离效果不好；液相色谱法能够实现有效分离，但定性不准确、特异性差；气相色谱串联质谱法通常需要对样品衍生化，步骤繁琐、费时。相较以上方法，液相色谱串联质谱法具有特异性强、灵敏度高、重现性好、抗干扰强和定性准确等优点，是现阶段β-受体激动剂兽药残留检测的首选方法，应用十分广泛。不过，其前处理主要依赖固相萃取法净化，操作复杂、成本高、耗时长，影响实验效率。

QuEChERS前处理方法具有快速、简单、廉价、有效、可靠、安全等特点，是近年来兴起并快速得到商业化应用的一种方法。本实验在已有研究基础上，用QuEChERS法进行样品前处理，简化了实验步骤，节约了处理时间，降低了实验成本，丰富了样品类型，为动物源性食品中β-受体激动剂批量化检测提供了新思路。

一、材料与方法

1.仪器与试剂。（1）主要仪器。TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪、U3000高效液相色谱仪：美国Thermo Fisher公司；台式离心机：盐城安信；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；超声波清洗器：上海晶坛仪器制造有限公司；涡旋混合器：Scientific industries；电子天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司。

（2）标准品及试剂。标准品沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、非诺特罗、特布他林、氯丙那林、西马特罗、妥洛特罗、喷布特罗（纯度≥98.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；色谱纯甲醇、乙腈、甲酸：美国Thermo Fisher公司；实验用水：屈臣氏蒸馏水。

2.样品处理。（1）提取。称取样品2g（精确至0.01g），置于50mL塑料离心管中，加入15mL乙腈溶液及缓冲盐包SBEQ-CA8802-B，涡旋混匀3min，超声波提取10min，8000r/min离心6min，将上清液转移至对应净化管SBEQ-CA8803-25。按以上步骤重复提取一次，合并两次提取液。

（2）净化。将净化管中的提取液涡旋混匀5min，8000r/min离心6min。转移净化后的上清液于鸡心瓶中，40℃减压蒸发至近干。加入1mL的50%（v/v）乙腈水溶液溶解，涡旋混匀3min，溶液过0.22μm滤膜，供液相色谱-质谱联用仪测定。

3.标准溶液制备。（1）单一标准溶液的配制。分别称取9种β-受体激动剂标准物质及3种内标物质各10mg（精确到0.01mg，对于含盐或者含酸的标准物质应进行相应的含量折算后再称取），用甲醇溶解后定容至10mL容量瓶中，配制成1.0mg/mL的单一标准储备液，在-20℃下保存待用。

（2）混合标准溶液的配制。从上述9种单一标准溶液中分别准确吸取1.0m置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容为100μg/mL的混合标准储备液，在-20℃下保存待用。将上述储备液用甲醇稀释为1μg/mL的混合标准中间液，用于优化质谱参数，使用时根据需要用流动相稀释配成合适的基质标曲点。采用同样的步骤配制混合内标中间液。

4.液相色谱-质谱/质谱条件。（1）色谱条件。色谱柱：Hypersil GOLD C18柱（2.1mm×100mm，1.9μm），美国Thermo Fisher公司。流动相：A泵为0.1%（v/v）甲酸水溶液，B泵为0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序：0min，96%A；2min，96%A；12min，40%A；12.1min，96%A；16min，96%A。流速：0.3mL/min。柱箱温度：30.0℃。进样量：5μL。

（2）质谱条件。离子源：ESI；扫描方式：正离子；检测方式：选择反应监测（SRM）；电喷雾电压（V）：3000；雾化气温度（℃）：300；离子源温度（℃）：350；鞘气流速（arb）：35；辅助气流速（arb）：10；监测离子对、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数详见表1。

二、结果与分析

1.前处理方法优化。QuEChERS法的应用在实验前处理阶段优势明显，能够分析的基质类型更加丰富，处理时间可降低至约1.5h（按n=6计算），提高了检测效率。QuEChERS法、农业部1025号公告-18-2008、GB/T 22286-2008方法对沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、非诺特罗、特布他林、氯丙那林、西马特罗、妥洛特罗、喷布特罗的平均回收率（n=7，添加量5μg/kg）分别为：79.1、77.5、83.0，84.5、82.0、85.8，88.4、90.6、87.7，88.0、92.0、81.8，80.5、79.9、79.6，98.0、102、89.3，76.9、80.0、74.0，93.0、89.6、101，91.5、92.8、95.0，无显著差异，均符合相关检测标准要求。

2.仪器条件优化。优化色谱和质谱条件，得到色谱峰峰形最好、响应最高的参数信息，建立仪器方法，进行序列信息采集。本实验获得的9种β-受体激动剂的SRM扫描色谱图如图1所示。

3.方法的线性及检出限。按照优化的仪器条件，对混合标准工作溶液系列进行测定，采用内标法定量，分别以标准溶液中被测组分与内标物浓度比值、被测组分与内标物峰面积比值作为横、纵坐标，绘制标准曲线，得到沙丁胺醇、克伦特罗、莱克多巴胺、非诺特罗、特布他林、氯丙那林、西马特罗、妥洛特罗、喷布特罗对应的回归方程、相关系数R2、方法检出限（μg/kg）分别为：Y=1.322e-1X+1.027e-1、Y=1.267e-1X-1.923e-2、Y=2.472e-1X+7.959e-2、Y=8.703e-3X-3.278e-4、Y=2.024e-2X-2.502e-3、Y=9.19e-2X+1.083e-2、Y=6.764e-2X+7.326e-2、Y=1.266e-1X-1.923e-2、Y=4.921e-2X+1.26e-2；0.9997、0.9995、0.9997、0.9996、0.9993、0.9991、0.9991、0.9998、0.9999；0.25、0.20、0.10、0.20、0.25、0.20、0.25、0.10、0.10。结果表明，9种β-受体激动剂在0.5-20ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R2为0.9991-0.9999，方法检出限为0.1-0.25μg/kg，满足畜产品中β-受体激动剂残留检测要求。

4.方法的精密度和加标回收率。随机选取市售猪肉、猪肝、牛肉、羊肉样品，按2个浓度水平加入9种β-受体激动剂混合标准溶液制成加标样品，按照本方法对每个添加水平重复测定7次，计算加标回收率和相对标准偏差，结果如表2所示。由表2可知，9种β-受体激动剂的加标回收率为72.8%-106.2%，满足相关检测要求，相对标准偏差（RSD）为2.7%-9.1%，说明该方法结果可靠、准确。

综上所述，本实验基于QuEChERS提取包与净化包的使用，对不同类型样品基质的净化效果良好，与农业部1025号公告-18-2008及GB/T 22286-2008标准方法相比，极大地缩短了提取和净化时间，丰富了样品基质类型，提高了样品前处理效率，9种β-受体激动剂的标准曲线线性关系良好，方法检出限、样品回收率和方法精密度等均符合实际检测相关要求。因此，可以通过该方法实现对不同类型样品的快速处理和检测，为应对大批量样品检测提供参考。

作者简介：王苏乐（1989-），男，汉族，内蒙古锡盟人，助理工程师，大学本科，研究方向为农产品中农兽药残留检测。

海娜（1987-），女，蒙古族，内蒙古呼和浩特人，讲师，硕士研究生，研究方向为生物学。