磁共振波谱检测三阴性乳腺癌患者尿液代谢生物标志物预测化疗敏感性的临床研究

何向明 邹德宏 张永芳 赵帅 顾金苹

根据美国癌症协会的估计，在女性癌症患者中，乳腺癌是2022 年美国新侵袭性癌症病例中发病率最高的肿瘤（约占全部新发肿瘤的31%）；此外，乳腺癌的死亡人数位居第二，在新发癌症死亡病例中占15%[1]。三阴性乳 腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）占所有乳腺癌的10%～20%[2]，由于缺乏雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progenstogen receptor，PR）和人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）的表达，化疗是TNBC 患者主要的治疗方法之一[3]。化疗包括术前新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NAC）、术后辅助化疗以及晚期的解救化疗等，NAC 是中晚期TNBC 的标准治疗方案之一，通过NAC，可以筛选不同化疗敏感性的TNBC[4]，对于化疗不敏感者，可给予强化治疗，以提高治疗效果[5]。早期预测NAC 敏感性，对于提高患者治疗效果、减少不必要的治疗反应具有重要的意义。如何早期预测NAC 疗效，从肿瘤及其周围环境入手是主要的研究重点[6-8]，但这些研究均不能很好覆盖TNBC 异质性的特点，预测效率不高。肿瘤的发生、发展，是肿瘤自身和周围环境联合作用的结果，因此从代谢入手，可能可以更好地说明肿瘤的生物学特点，从而预测化疗敏感性[9]。

代谢组学技术提供了从整体探讨TNBC 特征的工具。代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白组学后另一重要的组学技术，可从整体上提供肿瘤的代谢特点[10]。代谢组学是用于分析机体在受到影响或扰动过程中代谢小分子变化的技术，它是系统生物学的一部分，是其他组学的下游信息。研究发现，在TNBC 上，与正常细胞相比，TNBC 显示出较低水平的谷胱甘肽[11]；与Luminal 型乳腺癌比，TNBC 表达的氨基酸、核苷酸和核苷酸糖水平以及与增殖相关的代谢物（如胆碱）水平较高[12-13]。TNBC 有其自身的代谢特点，因此，可利用代谢组学技术来探索TNBC 不同化疗敏感性的代谢差异。

因此，基于临床上TNBC NAC 不同的化疗敏感性结局，以及肿瘤存在于宿主中的代谢特征的背景，本研究拟建立基于磁共振波谱（nuclear magnetic resonance,NMR）代谢组学技术，分析不同化疗敏感性TNBC 患者尿液的代谢表型，探讨可区别不同化疗敏感性TNBC 患者的尿液代谢生物标志物，为早期预测NAC敏感性提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019 年5 月至2020 年12 月在浙江省肿瘤医院接受NAC 的的女性TNBC 患者52 例，均为接受EC-T（P）方案化疗患者，具体为：3 周方案[表阿霉素（E）90 mg/m2、环磷酰胺（C）500～600 mg/m2、多西他赛（T）100 mg/m2]或2 周方案[表阿霉素（E）90 mg/m2、环磷酰胺（C）500～600 mg/m2、紫杉醇（P）175 mg/m2]。纳入标准：（1）病理学检查确诊为原发TNBC；（2）符合NAC 指征并执行NAC；（3）年龄20～70 岁；（4）体力状况（performance status，PS）评 分0～1 分；（5）18 kg/m2≤BMI≤30 kg/m2；（6）无糖尿病、甲状腺功能异常等代谢性疾病；（7）同意入组本研究并签署知情同意书。排除标准：（1）非原发TNBC；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）非NAC 患者；（4）合并血液系统疾病或肾脏疾病；（5）BMI＞30 kg/m2或＜18 kg/m2；（6）年 龄＞70 岁 或＜20岁；（7）不能耐受化疗及手术者或PS 评分＞1 分者。本研究经浙江省肿瘤医院医学伦理委员会批准[批件号：IRB-2023-137 号（科）]，留取患者第1 次化疗前晨起第1 次尿液的中段尿[14-15]，保存于医院标本库中。为了减少饮食对患者尿液代谢物的影响，在采集前1 天，患者避免高盐高脂及刺激性饮食，采集前晚20：00 后禁食[16]。患者经NAC 及手术后，参照《RECIST 1.1 版》对NAC 疗效进行评价，病理完全缓解（pathological complete response，pCR）患者8 例（pCR 组），病理部分缓解（pathological partial response，pPR）患者28 例（pPR组），病理稳定（pathological stable disease，pSD）者16 例（pSD 组）。3 组患者年龄、BMI、Ki-67、月经状态、肿瘤分期比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

表1 3 组患者年龄、BMI、Ki-67、月经状态、肿瘤分期比较

1.2 代谢组学检测 将52 例患者尿液解冻，各移取500 μl 与50 μl 重 水 配 制 的PBS 混 合（1.5 mol/L，K2HPO4/NaH2PO4，pH 7.40，含TMSP），以稳定尿液pH，减少因pH 改变引起的化学位移变化差异。混合后将尿液样品离心（12 000 g，10 min，4 ℃），然后取500 μl上清液到5 mm NMR 核磁管中，其中TMSP 用于化学位移的定标。所有尿液标本的NMR 谱均在BRUKER 600 MHz 核磁共振谱仪（德国BRUKER 公司）中采集，使用的是BRUKER 三共振反向探头（TXI 探头），质子共振频率600.13 MHz，实验温度设定在300 K。实验采用一维NOESY 脉冲序列，具体参数如下：混合时间100 ms，谱宽8 403 Hz，弛豫延迟2 s，采样时间3.999 s，数据采集点数64 K，累加128 次，加0.3 Hz 窗函数进行Fourier 变换。

1.3 尿液代谢物指认 根据Bekzod Khakimov 等编辑的基于NMR 的代谢组学软件Signature Mapping（Sig-Ma）对尿液中的代谢物进行指认[17]，并进行相对浓度的计算。根据HMDB 数据库（https://hmdb.ca/）、Chenomx NMR Suit 软件和相关文献，指认尿液中的代谢物[18]。

1.4 统计学处理 根据NMR 的谱峰相对积分计算尿液代谢物的相对浓度，对尿液代谢物进行主成分分析（principal component analysis，PCA），分析不同化疗敏感性患者的代谢表型差异；随后利用K-近邻算法（Knearest neighbor，KNN），并利用二阶蚱蜢优化算法（binary grasshopper optimization algorithm，GOA）[19]和情绪分析算法（Sentiment analysis，SA）[20]对分组贡献的特征代谢物进行优化选择，寻找差异性代谢物，利用ROC曲线判断差异性代谢物作为化疗敏感性标志物的潜力，以AUC 值作为评价指标。

2 结果

2.1 患者尿液代谢物指认结果 在尿液样本中共指认出94 种代谢物，见表2。

表2 3 组患者患者尿液样本中94 种代谢物相对浓度比较

2.2 不同患者的尿液代谢表型分析 PCA 得分图结果显示pCR 组、pPR 组和pSD 组患者的尿液样本是基本可以区分的，见图1A；3 组两两比较，每组样本是可以区分的，见图1B-D。

图1 3 组患者尿液代谢物相对浓度的主成分分析得分图（A：3 组比较；B：pSD 组与pPR 组比较；C：pSD 组与pCR 组比较；D：pPR组与pCR 组比较）

对尿液样本中94 种代谢物进行Kruskal-WallisH检验，并对其结果进行分析发现，pSD 组与pPR 组患者共有57 种代谢物相对浓度比较差异有统计学意义（均P＜0.05），其中15 种代谢物在pSD 组中的相对浓度升高，42 种代谢物在pSD 组中的相对浓度降低；pSD 组与pCR 组患者共有34 个代谢物相对浓度比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中12 种代谢物在pSD 组中的相对浓度升高，22 种代谢物在pSD 组中的相对浓度降低。pPR 组与pCR 组患者共有51 种差异性代谢物相对浓度比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中30 种代谢物在pPR 组中的相对浓度升高，21 个代谢物在pPR 组中的相对浓度下降。见表2。

2.3 基于KNN 的差异性代谢物寻找结果 利用KNN分类进行样本的归属分类，对患者样本数量进行70%的训练和30%的验证，优化选择后的差异性代谢物可用于提高不同患者归属的区分度。

根据GOA 和SA 算法，结果发现17 种代谢物对3组患者尿液的分类都有一定的作用。对这17 种代谢物进行ROC 曲线分析，并计算其AUC 值，见表3。根据AUC 值（AUC＞0.8）[21]，发现蛋氨酸可以作为不同TNBC 化疗敏感性的潜在生物标志物。

表3 尿液代谢物的ROC 曲线分析结果

3 讨论

TNBC 是一种异质性很强的乳腺恶性肿瘤[22]，较其他分子类型的乳腺癌，缺乏特定的靶标，容易复发转移、预后差，化疗是其主要治疗手段之一，尤其是NAC，现有的指南推荐根据NAC 疗效采取不同的强化治疗手段，如何早期预测肿瘤对化疗的反应，以给予个体化的治疗是目前研究的热点，也是难点。鉴于此，本研究基于NMR 代谢组学尿液代谢特征，探讨能预测TNBC NAC 敏感性的代谢标志物。本研究中，3 组患者在临床病理学指标上差异均无统计学意义，这说明仅仅利用临床病理学指标不能很好地区分不同TNBC 患者的化疗敏感性。本研究通过对52 例不同化疗敏感性的TNBC 患者尿液进行基于NMR 的代谢组学分析，发现3 组患者的尿液表型是可以区分的，约20%的代谢物对分类有贡献。随后本研究根据KNN 分类，进行差异性代谢物的分析，分别利用两种算法（GOA和SA），发现了16 种潜在的生物标志物（代谢物）用于区分pPR 组和pSD 组患者，14 种潜在生物标志物（代谢物）用于区分pPR 组和pCR 组患者，13 种潜在生物标志物（代谢物）用于区分pSD 组和pCR 组患者。最后根据ROC 曲线的AUC 值进行3 组患者尿液样本的综合判断，发现蛋氨酸是潜在的生物标志物，可用于不同化疗敏感性的判断。

蛋氨酸参与体内蛋氨酸转硫途径，在生物过程中发挥着重要作用，如氧化还原和甲基化反应[23]。笔者团队前期研究发现甲基化异常在血清代谢研究中也有发现[24]。在血清代谢研究中，笔者团队发现血清中的N,N-二甲基甘氨酸是潜在的生物标志物，N,N-二甲基甘氨酸是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢通路中的产物，是N,N-二甲基甘氨酸是甘氨酸甲基化的产物，甲基化程度会影响N,N-二甲基甘氨酸的产生，甲基化反应可以介导甲基转移并调节生命活动，不同区域的甲基化程度与乳腺癌的预后相关[25]。另一方面，蛋氨酸是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路的重要代谢物，该代谢通路是肿瘤细胞增殖过程中的关键代谢通路[26]。因此，蛋氨酸可以成为TNBC 不同化疗敏感性患者的潜在生物标志物，具有较高的临床应用价值。

采用尿液标本进行代谢组学检测，取材方便是其优势之一。Lo 等[27]通过对60 例乳腺癌患者NAC 前的尿液进行代谢组学分析，发现化疗效果好的患者尿液中的乙酰基精胺、亚精胺、去甲肾上腺素和多巴胺的水平显着高于化疗无反应者组，将这些代谢物与临床因素结合以识别NAC 应答者，预测模型显示AUC 为0.949。但使用该标本受到的影响较多，基质效应是生物样品中目标分析物定量的主要挑战之一，不同个体的尿液浓度差异很大，因为它可能受到饮食、摄水量和采样时间的影响，研究观察到不同尿液样本中基质效应会导致的信号大幅波动[28]，尽管可以对标本进行校准，但仍会影响数据的准确性。而且尿液需要经过肾小球滤过，可能很多有意义的代谢产物被过滤，导致不能检测出有意义的结果。在本研究中，尿液标本均采用化疗前、晨起第1 次尿液，并排除了存在自身代谢性疾病患者的入组，以控制对尿液代谢产物的影响因素。尽管本研究的结论可以通过尿液模型及差异性代谢产物来预测NAC 敏感性，是否可以推广，尚需要进一步论证。

本项目存在一些局限性。首先，本研究基于NMR代谢组学研究不同化疗敏感性的尿液代谢物的相对浓度，没有计算其在尿液中的绝对值，在后续临床研究推广的数据统一性具有一定挑战；另外，本项目收集的临床患者样本量偏少，后续需要更多的临床患者尿液样本。

综上，基于NMR 代谢组学特征提示不同化疗敏感性的TNBC 患者尿液具有不同的代谢表型，蛋氨酸可以作为区别不同代谢表型的潜在生物标志物。这可为早期预测TNBC 患者的化疗敏感性提供参考。