小黄鱼中杀香鱼假单胞菌实时荧光定量PCR 检测技术的建立

沈宁远，韩明明，陈琳，詹炜，刘峰，谢庆平，徐万土，陈黎明，楼宝

(1.浙江海洋大学水产学院，浙江舟山 316022；2.浙江省农业科学院水生生物研究所，浙江杭州 310021；3.宁波市象山县水产技术推广站，浙江象山 315702；4.象山港湾水产苗种有限公司，浙江象山 315702)

小黄鱼Larimichthys polyactis是我国传统“四大海产”之一，历来是重要的捕捞鱼类[1]。自2015 年首次实现全人工育种以来，小黄鱼的各项养殖技术获得了长足发展[2]，但在养殖过程中发现该鱼存在易染病、易死亡的特点[3]。其中，内脏白点病是小黄鱼养殖过程中的一种常见疾病，染病后在肝、肾、脾等内脏部位出现大量白色结节而鱼体表面并无明显病状，因而不易被及时发现。该病感染率很高并能在短时间内造成大规模死亡，加之目前尚没有有效治疗药物，因此一旦发病往往给养殖企业造成重大经济损失。在发病时间上，以往该病主要在每年的4——5 月以及11——12 月、水温为16～21 ℃时发生，流行规律调查显示目前已经有发病地区扩大、发病时期延长的趋势。

作为内脏白点病的致病菌，杀香鱼假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida最早在在日本香鱼Plecoglossus altivelis中分离而来[4]。从分类上该菌属细菌界，变形菌门，γ-变形菌纲，假单胞菌目，假单胞菌科，假单胞菌属，恶臭假单胞菌组，为革兰氏阴性杆状需氧菌，具有极性鞭毛[5]。近年来由该菌引起的鱼类疾病的研究已有相关报道，例如，AKAYLI,et al[6]在人工养殖的虹鳟Oncorhynchus mykiss幼体中发现一种新的假单胞菌：杀香鱼假单胞菌；ZHANG,et al[7]通过对养殖大黄鱼内脏白点病进行研究证明了该病是由细菌性病原杀香鱼假单胞菌引起；MAO Zhijuan,et al[8]则对大黄鱼Larimichthys crocea内脏白点病的病原杀香鱼假单胞菌株完成了菌株鉴定工作。

目前针对鱼类病原的快速检测方法主要有16S rDNA 检测技术、核酸杂交技术、普通PCR 检测技术、多重PCR 技术和荧光定量PCR 技术等。其中荧光定量PCR 技术在高效、快速和灵敏度高的基础上，还具有对病原定量的优势，因此具有重要的发展前景。在对杀香鱼假单胞菌定性检测方面，IZUMI,et al[9]以杀香鱼假单胞菌中DNA 回旋酶B 亚基基因(gyrB)的一段大小为520 bp 的特异片段为模板建立了对该菌的套式PCR 检测技术；袁雪梅等[10]根据rpoD基因序列设计特异性引物建立了LAMP 检测方法。定量检测方面，周涛等[11]根据该菌rpoD的基因序列设计特异引物并建立了SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR 方法，经验证该方法检测杀香鱼假单胞菌的灵敏度为1.9×103copies·μL-1。崔晓莹等[12]基于抗病育种选育，利用杀香鱼假单胞菌的gyrB基因与大黄鱼DNA 回旋酶B 亚基基因(gdf-8) 设计引物和实时荧光定量PCR 技术，实现了对脾脏中该病菌进行相对定量。

养殖水体是杀香鱼假单胞菌的主要来源，以养殖水体中该菌的含量变化为研究对象，建立针对小黄鱼杀香鱼假单胞菌的快速定量检测技术对实现内脏白点病有效预警、采取预防措施、降低死亡率和实现小黄鱼规模化养殖具有重要意义。为实现这一目的，本研究将在前人的研究基础上，利用从小黄鱼中分离获得的杀香鱼假单胞菌菌种来构建质粒标准品，设计特异引物并建立荧光定量PCR 检测方法，力图通过对养殖水体和病鱼中杀香鱼假单胞菌进行定量检测来实现对内脏白点病的有效预警。

1 材料与方法

1.1 菌株分离及鉴定

1.1.1 菌种分离

实验所用菌株从小黄鱼内脏白点病病鱼中分离得到。在无菌条件下，用无菌的解剖刀将有白色结节的肝脏划开后，用无菌接种环在其内部划线，并在28 ℃条件下于TSA 固体培养基(表1)上培养24 h，之后，挑取单菌落并于28 ℃、200 r·min-1条件下在TSA 液体培养基(表1)中继续进行摇床过夜培养。

1.1.2 菌种鉴定

摇床培养结束后，吸取1 mL 菌液加入1.5 mL 无菌的离心管中，在3 000 r·min-1下离心10 min，去掉上清液，按照提取试剂盒说明书(爱基因，宁波)提取细菌DNA，利用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，进行16S rDNA PCR 扩增反应，具体步骤按照PCR 反应试剂盒(诺唯赞，南京)进行(表2)。PCR 反应完成后对PCR 扩增产物进行测序，然后通过NCBI 数据库进行Blast 比对，确定该菌株种类。

表2 16S rDNA PCR 反应体系及条件Tab.2 The reaction system and conditions of 16S rDNA PCR

1.2 荧光定量PCR 引物设计

利用NCBI 中“pick primers”工具对1.1 所得序列设计荧光定量PCR 反应引物，并委托擎科生物有限公司(杭州，中国)进行引物合成。

1.3 荧光定量PCR 技术体系建立

1.3.1 杀香鱼假单胞菌标准品的构建

参照IZUMI，et al[9]的方法对实验所得的杀香鱼假单胞菌DNA 进行套氏PCR 反应，反应体系组成如下：(1) PCR 1：Prime STAR Max Premix(2x) (Takara，日本) 25 μL；PL-G1F 和PL-G1R 各1 μL；DNA 模板2 μL；ddH2O 21 μL。(2) PCR 2：Prime STAR Max Premix (2x) 25 μL；PL-G2F 和PL-G2R 各1 μL；PCR 1产物2 μL；ddH2O 21 μL。两步PCR 反应条件均为94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；66 ℃，20 s；72 ℃，5 s；35 个循环；72 ℃，2 min；16 ℃，10 min。利用“AxyPrepTM PCR clean up kit”(Axygen，美国)试剂盒对PCR 2 产物进行纯化，并按照“pClone007 Blunt Simple Vector Kit”质粒连接试剂盒(擎科生物，北京)操作说明进行连接。

具体如下：

(1)连接：按照纯化后的PCR 产物1 μL、pClone007 Blunt Simple 1 μL 和10x Tope Mix 1 μL 进行混匀，并用ddH2O 补足到10 μL，在室温下反应5 min。

(2)转染：取100 μL 在冰浴上融化的大肠杆菌感受态细胞，加入(1)的连接产物，轻轻混匀，冰上静置25 min。42 ℃水浴90 s，迅速转移到冰浴中静置2 min。

(3)向离心管中加入500 μL LB 液体培养基，于37 ℃、200 r·min-1条件下复苏1 h 后8 000 r·min-1离心1 min，将200 μL 上清与沉淀再次混匀后均匀涂布到含AMP 的LB 固体培养基上，将平板倒置并于37 ℃下过夜培养。

(4)鉴定：将从(3)中的培养基上挑取8 个单菌落加入到10 μL 无菌水中，取2 μL 作为模板，并按照Izumi 的方法进行PCR 反应。反应完成后进行序列测定。

鉴定成功后，将剩余的8 μL 菌液加入到LB(AMP+)液体培养基进行选择培养，并随后进行菌种保存。

1.3.2 杀香鱼假单胞菌荧光定量标准曲线建立与反应体系优化

将1.3.1 中保存的含有表达杀香鱼假单胞菌特异片段质粒的大肠杆菌进行复苏和摇床培养，并使用Axyprep Plasmid miniprep kit 试剂盒(Axygen，美国)提取质粒。测定质粒浓度并根据公式：质粒拷贝数(copies·μL-1)=质粒浓度(ng·μL-1)×6×1014/(660×碱基数)[13]进行拷贝数换算。用ddH2O 对质粒逐级进行10 倍稀释，共8 个梯度。以稀释后各浓度梯度的质粒为模板按如下程序进行荧光定量PCR 反应并生成标准曲线(n=3)(QIAquant96 2plex，QIAGEN，德国)：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s；60 ℃退火和延伸45 s。根据反应结果，调整引物和模板的加入量，摸索退火和延伸步骤的温度和时间，优化扩增条件。

1.3.3 引物特异性检测

利用实验室前期采集到的感染刺激隐核虫Cryptocaryon irritans、哈维氏弧菌Vibrio harveyi和虹彩病毒Iridovirus的小黄鱼病鱼材料，分别参照SC/T 7217-2014、CONEJERO,et al[14]和GB/T 36191-2018 提供的检测方法获得3 个病原的目的片段。

利用1.2 中合成的引物，分别以1.3.1 中提取到的质粒和获得的刺激隐核虫、哈维氏弧菌和虹彩病毒特异片段为模板进行荧光定量PCR 反应，通过比较上述4 种病原的扩增情况确定所设计引物的特异性。

1.4 荧光定量PCR 反应技术体系质量检测

1.4.1 重复性检测

比较1.3.2 中8 个稀释梯度下标准品的Ct 值的组内重复性和组间重复性。组内重复性包括每个稀释梯度下Ct 值的平均值、标准差和变异系数。组间重复性主要包括间隔1 d 后用相同的方法对同一样品进行再次检测时各Ct 值的平均值、标准差和变异系数。

1.4.2 灵敏性和准确性检测

将1.3.2 中的质粒标准品按10 倍数量逐级稀释10 个梯度，以每个梯度的质粒DNA 为模板分别进行荧光定量PCR 反应，通过有效Ct 值来确定可以有效检测到的最小拷贝数，并将扩增产物进行测序和BLAST 比对分析，以对荧光定量PCR 反应体系的准确性进行检测。

另外，以小黄鱼养殖水体DNA 为模板，使用ddH2O 对DNA 进行10 倍数量级共8 个梯度的稀释，以各梯度的DNA 为模板分别进行荧光定量PCR 和普通PCR 套式反应并对两者的PCR 产物分别进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，通过比较条带亮度对荧光定量PCR 方法和普通PCR 方法的灵敏度进行比较。

1.4.3 有效性检测

在2021.11.1——2021.12.1 阶段内，对小黄鱼养殖区域水体进行逐天采样，使用采水器采取鱼排内养殖水体，水样存放于15 mL 无菌离心管中且于-20 ℃保存，使用DNA 提取试剂盒(爱基因，宁波)提取水体DNA，并利用已建立的荧光定量PCR 方法对水样中杀香鱼假单胞菌含量进行定量检测。

2 结果

2.1 菌种鉴定

通过测序获得序列片段为：

通过BLAST 对比结果如图1 所示，通过比对分析确定从小黄鱼中分离到的菌种为杀香鱼假单胞菌。

图1 菌种blast 对比结果Fig.1 Blast comparison results of strain

2.2 引物设计结果

利用NCBI 中“pick primers”工具对1.1 所得序列设计荧光定量PCR 反应引物，并委托相关生物公司进行引物合成，引物结果如表3 所示。

表3 杀香鱼假单胞菌荧光定量PCR 引物序列Tab.3 The list of primers sequences of P.plecoglossicida for real-time PCR

2.3 引物特异性检测

参照SC/T 7217-2014、CONEJERO，et al[14]和GB/T 36191-2018 分别对小黄鱼来源的刺激隐核虫、哈维氏弧菌和虹彩病毒进行检测和序列鉴定，获得的上述3 种病原的特定序列和比对结果如下。

其中刺激隐核虫的序列和比对结果如图2 所示。

图2 刺激隐核虫的序列和比对结果Fig.2 Sequence and alignment of the C.irritans Brown

哈维氏弧菌的序列和比对结果如图3 所示。

图3 哈维氏弧菌的序列和比对结果Fig.3 Sequence and alignment of the V.harveyi

虹彩病毒的序列和比对结果如图4 所示。

图4 虹彩病毒的序列和比对结果Fig.4 Sequence and alignment of the iridescent virus

分别以上述3 种病原的和1.3.2 中提取到的质粒DNA 为模板，利用设计合成的引物进行荧光定量PCR 反应结果如图5 所示，结果显示只有杀香鱼假单胞菌标准品质粒(A)存在有效荧光信号，其余3 种病原(B，C，D)均无有效荧光信号，表明该引物有很好的特异性。

图5 SYBR Green I 荧光定量PCR 方法的特异性测定Fig.5 Specificity determination of SYBR Green I fluorescence quantitative PCR

2.4 杀香鱼假单胞菌重组质粒构建结果

送测序列结果与基因库杀香鱼假单胞菌序列比对一致，证明标准品构建完成。

“杀香鱼假单胞菌-pClone007 simple vector”重组质粒目的片段序列比对结果如图6 所示。

图6 “杀香鱼假单胞菌-pClone007 simple vector”重组质粒目的片段序列比对结果Fig.6 The sequences comparison results for target fragments of recombinant plasmids of"P.plecoglossicida-pClone007 simple vector"

2.5 荧光定量PCR 反应体系构建结果

2.5.1 标准曲线绘制与反应体系优化结果

稀释后的8 个浓度梯度的标准品反应扩增曲线如图7(a)所示。以标准品质粒起始拷贝数的对数为横坐标，以Ct 值为纵坐标，绘制标准曲线，其相关数据如图7(b，c)，其斜率为-3.17，截距为34.64，相关系数R2=0.995 51。对各稀释梯度下PCR 扩增反应产物的溶解曲线进行分析，结果显示各反应的溶解温度均为86～87 ℃(图7d)。

图7 杀香鱼假单胞菌SYBR Green I 荧光定量PCR 的标准曲线及相关参数Fig.7 The standard curve of SYBR Green I fluorescence quantitative PCR for P.plecoglossicida and relative parameters

通过多次实验结果比较，发现退火和延伸温度为60 ℃、延伸时间为45 s，引物0.3 μL 时(浓度为10 μmol·L-1)时反应的特异性及扩增效率最佳。最佳反应条件为：(1)预变性：95 ℃，30 s；(2)变性：95 ℃，10 s；(3)退火和延伸：60 ℃，45 s，35 个循环。PCR 仪默认融解曲线条件：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。

2.5.2 荧光定量PCR 反应体系的重复性检测结果

通过用建立的SYBR Green I 荧光定量PCR 方法对浓度为101，102，103，104，105，106，107，108copies·μL-1的标准品质粒进行检测(n=3)，扩增反应曲线如图8 所示，结果表明建立的SYBR Green I 荧光定量PCR 组内变异系数为0.08%～0.82%。隔天用同样的方法对同一批样品进行检测，得出组间变异系数为0.08%～0.8%(表4)。

图8 SYBR Green I 荧光定量PCR 方法的重复性检测Fig.8 Repeatability test of SYBR Green I fluorescence quantitative PCR method

表4 SYBR Green I 荧光定量PCR 方法的重复性检测Tab.4 Repeatability test of SYBR Green I fluorescence quantitative PCR

2.5.3 荧光定量PCR 反应体系的准确性和灵敏性检测结果

以10-1，100，101，102，103，104，105，106，107，108copies·μL-1的质粒标准品为模板进行荧光定量PCR 反应，并对PCR 产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果显示能检测出质粒的最小浓度为10 copies·μL-1(图9)。进一步通过对荧光定量PCR 反应产物进行测序，测序结果如下：

图9 不同浓度下质粒标准品荧光定量PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.9 The Agarose gel electrophoresis results of fluorescence quantitative PCR products of plasmid standard at different concentrations

图10 荧光定量PCR 反应产物BLAST 比对结果Fig.10 BLAST comparison results of fluorescence quantitative PCR reaction products

以小黄鱼养殖水体DNA 为模板，使用ddH2O 对DNA 逐级进行10 倍稀释，共8 个梯度，以各梯度的DNA 为模板分别进行SYBR Green I 荧光定量PCR 和普通PCR，结果显示100 倍稀释条件下，SYBR Green I 荧光定量PCR 方法仍能对水体DNA 进行有效检测(图11a)，而普通PCR 无法检测出任意稀释梯度的DNA(图11b)。

图11 SYBR Green I 荧光定量PCR(a)和普通PCR 方法(b)的灵敏度比较Fig.11 Comparison of sensitivity between SYBR Green I fluorescence quantitative PCR and conventional PCR

2.5.4 有效性检测结果

利用本研究建立的荧光定量检测技术对2021 年11 月宁波象山港小黄鱼养殖区域水样中的杀香鱼假单胞菌进行定量检测，结果如图12 所示，发现该月份内养殖水体中杀香鱼假单胞菌的浓度在256～8 078 copies·μL-1范围内波动，但也存在极端情况，如在11.14、11.21 和11.27 的浓度分别为2.16×104、1.36×104和2.86×104copies·μL-1。

图12 小黄鱼养殖水域水体杀香鱼假单胞菌含量变化Fig.12 Content variation of P.plecoglossicida in the aquiculture waters of L.polyactis

3 讨论

近年来，随着养殖密度的增加和养殖水质恶化，病害对鱼类养殖的威胁依然严峻，例如，根据2020 年渔业统计年鉴，2019 年全国水产品养殖总量为50 790 728 t，水产苗种总产值为6 584 904.54 万元，而由病害造成的经济损失高达231 119.62 万元。小黄鱼是我国重要的养殖新兴鱼类，自2015 年首次实现全人工养殖以来各项养殖技术不断完善[3,14]，并且成功结束养殖中试阶段，开始进入产业化推广阶段。养殖成活率的高低对后续能否实现产业化发展至关重要，养殖中发现体外白点病、体内白点病和弧菌病是小黄鱼养殖中的主要疾病，其中相比体外白点病和弧菌病有明显的发病症状，体内白点在外观上无明显症状，养殖中因此也往往不能及时采取预防措施。针对上述现状，建立病害快速检测技术及开发预警系统对减少由病害造成的经济损失具有重要促进作用。

杀香鱼假单胞菌在分类上属于恶臭假单胞菌属[6,15]，研究已经发现该菌对多种鱼类如香鱼Plecoglossus altivelis[4]、虹鳟[6]和大黄鱼中均存在致病现象[8,16]。大黄鱼感染会导致病鱼的脾脏、肾脏和肝脏出现白色结节，并导致高死亡率。本实验室根据杀香鱼假单胞菌中DNA 回旋酶B 亚基基因(gyrB)的一段大小为520 bp 的特异片段设计特异性引物，建立了杀香鱼假单胞菌的荧光定量PCR 检测方法[9]。经过检验，该方法与常见小黄鱼其他常见疾病病原无交叉反应，具有较强的特异性，灵敏度达到10 copies·μL-1。标准曲线显示出良好的线性相关性，相关系数可达0.996，扩增效率为107%，组内和组间变异系数均小于0.82%，重复性好。实际应用验证方面，我们发现运用本研究建立的技术在对2021 年11 月份水体中杀香鱼假单胞菌定量时能检测到256 copies·μL-1的浓度水平，说明了与周涛等[11]针对该菌所建立的荧光定量PCR 检测方法能达到的1.9×103copies·μL-1最低水平相比，我们建立的方法具有更高的灵敏度，能有效实现对特定月份下水体中杀香鱼假单胞菌浓度较低时的有效定量检测，为后期实验中完成染病小黄鱼体内的带菌量定量检测、水质参数与病菌的含量变化之间的相关性分析并最终建立小黄鱼内脏白点病预警模型提供了有力的技术支撑。

4 结论

本研究利用杀香鱼假单胞菌DNA 回旋酶B 亚基基因(gyrB)中某一特异分子片段构建质粒标准品，通过设计特异性引物，建立了杀香鱼假单胞菌实时荧光定量PCR 检测技术，经重复性分析，该方法的组内和组间变异系数均小于0.82%，其灵敏度达到10 copies·μL-1。通过实际应用验证，本研究建立的方法与前人研究相比进一步扩大了水体中杀香鱼假单胞菌的有效定量检测范围，能够较精确地体现出该菌在养殖水体及鱼体内的季节性变化。