2019年辽宁省风疹流行病学及1E-L2亚型流行株基因特征分析

王文思，安晓慧，方兴，王艳

辽宁省疾病预防控制中心，辽宁 沈阳 110005

风疹病毒属于新建立的马氏病毒科（Matonaviridae）风疹病毒属（Rubivirus），为单股正链RNA 病毒，通常引起以发热、出疹等为主要临床特征的急性呼吸道传染病，多数患者感染后临床症状轻微，如皮疹、淋巴结肿大，偶伴关节痛、血小板减少症和脑病［1-3］。风疹病毒感染引起的最严重后果是先天性风疹综合征（congenital rubella syndrome，CRS）［4］，风疹病毒可穿过胎盘并导致胎儿感染，妊娠早期感染会导致流产、胎儿死亡或严重的先天缺陷，全球每年约10 万名儿童出生时患有CRS［3，5-6］。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）在2005年提出，基于包膜蛋白E1基因的739个核苷酸（nt 8 731 ～9 469）将风疹病毒划分为13 个基因型（1a、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B、2C），其中1E 基因型病毒具有广泛的地理分布，近年来在全球频繁发现［2，5］。为能够准确地进行风疹病毒溯源研究，RIVAILLER等［7］提出将1E 基因型进一步划分为5 个基因亚型（1E-L0、1E-L1、1E-L2、1E-L3、1E-L4），其中1E-L0 基因亚型为已消失的病毒，目前全球未再检测到；1EL1基因亚型主要在中国和俄罗斯等国家流行；1E-L2基因亚型主要流行于中国台湾、日本、马来西亚等东亚国家；1E-L3 基因亚型流行于突尼斯、印度和中国香港等；1E-L4 基因亚型则分布于也门、苏丹等东亚和西亚国家［7-9］。

风疹病毒感染是重要的公共卫生问题，风疹病毒的分子特征分析对于世界各地的流行特征描述、追踪新输入毒株及监测消除风疹具有重要意义。本研究对2019 年辽宁省风疹流行病学特征及风疹病毒基因型、基因亚型及氨基酸变异位点进行分析，为辽宁省风疹防控策略的制定和消除提供依据。

1 对象与方法

1.1 流行病学数据 2019 年辽宁省风疹发病率、发病地区及病例年龄构成等流行病学数据来源于中国疾病预防控制中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）法定传染病报告系统。

1.2 主要试剂 核酸提取试剂QIAamp Viral RNA Mini Kit 和QIAGEN One-Step RT-PCR Kit 购 自 德 国QIAGEN公司。

1.3 样本采集及病毒分离 辽宁省各区、县级疾病预防控制中心采集2019 年疑似风疹暴发和散发病例的咽拭子样本，于48 h 内冷藏运送至地市级CDC麻疹／风疹实验室，采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应进行病原学鉴定，检测为阳性的咽拭子样本冷藏运送至省级CDC 麻疹／风疹实验室，使用WHO 推荐的稳定转染了人淋巴信号激活因子的非洲绿猴肾细胞系（Vero／SLAM），于35 ℃培养箱中静置培养，盲传3代进行病毒分离。

1.4 病毒核酸提取、靶基因扩增及序列测定 使用核酸提取试剂QIAamp Viral RNA Mini Kit 从第3 代病毒培养物中提取病毒RNA，使用QIAGEN One-Step RT-PCR Kit 扩增阳性病毒分离株E1基因两个部分重叠的基因片段，即F1-480 bp（nt 8 633 ～9 112）和F2-633 bp（nt 8 945 ～9 577）。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，为保证序列的准确性，所有PCR产物均进行双向测序。

1.5 基因序列比对分析 利用Sequencher 软件（Version 5.4.5）将获得的两段风疹病毒基因序列（499和633 bp）拼接成E1-739 bp（nt 8 731 ～9 469）的基因片段，用于基因分型。利用BioEdit Sequence Alignment Editor software（Version 7.0.9）软件进行多序列比对和同源性分析；利用Mega软件（Version 7.0.20），应用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发生树（Kimura-2parameter核酸替代模型），通过bootstrap进行评估，抽样次数为1 000，并进行亲缘性关系及遗传距离分析［10］。

2 结果

2.1 2019年辽宁省风疹流行病学概况 2019年辽宁省风疹报告病例数为404 例，发病率为0.927／10万，总体发病情况在2017 — 2018 年风疹流行大幅下降后又出现回升。2019 年全年均有病例发生，呈明显季节性分布特征，以5 — 6 月份报告病例数最高，发病率分别为0.390／10 万和0.264／10 万，之后呈明显下降趋势，而11 月份有一个较小的反弹。2019 年辽宁省14 个城市均有风疹病例报告，报告病例主要集中在沈阳市（3.547／10 万）。见图1。1 ～2、3 ～4、5 ～6、7 ～14、15 ～19、≥20 岁年龄组病例发病率分别为0.957／10 万、0.397／10 万、0.370／10万、1.527／10 万、11.281／10 万和0.464／10 万，其中15 ～19岁年龄组为风疹发病的主要人群，见图2。

图1 2019年辽宁省不同城市风疹发病率Fig.1 Incidence of rubella in different cities of Liaoning Province in 2019

图2 2019年辽宁省不同年龄风疹发病率Fig.2 Incidence of rubella of different ages in Liaoning Province in 2019

2.2 2019年辽宁省风疹病毒分离株基因型别鉴定及亲缘性分析 2019 年辽宁省从7 个地市级共获得55株风疹病毒分离株（沈阳市26株、大连市20株、鞍山市1株、抚顺市1株、本溪市2株、丹东市1株、营口市4 株），与WHO 推荐的13 个基因型的32 株参考株构建系统进化树，55株风疹病毒分离株均属于1E 基因型，且这些分离株与来自马来西亚的参考株（RVi／Kuala Lumpur.MYS／0.01［1E］）亲缘性关系最为接近。毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.051%～99.864%和98.780%～100%。辽宁省不同地区风疹病毒分离株交织在一起，无明显的地区差别。本文删除了序列完全一致的风疹病毒分离株，最终选取17 株构建基因分型系统发生树，用于基因分型分析，见图3。

图3 2019年辽宁省风疹病毒分离株与WHO 各基因型参考株基于E1基因构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province and WHO reference strains of various genotypes based on E1 gene

2.3 2019年辽宁省风疹病毒分离株基因亚型鉴定及亲缘性分析 将2019 年辽宁省1E 基因型风疹病毒代表株（17株）与5个1E基因亚型（1E-L0、1E-L1、1EL2、1E-L3、1E-L4）的35条参考株序列基于E1-739 bp序列构建系统发育树。结果显示，2019 年辽宁省风疹病毒分离株均属于1E-L2 基因亚型，与2018 —2019 年间中国湖南、香港、吉林、浙江及日本流行的5 株1E-L2 基因亚型风疹病毒参考株（RVs／Changsha.CHN／51.18／1［1E-L2］、RVs／HongKong.CHN／25.19［1E-L2］、RVi／Jilin.CHN／13.19／2［1E-L2］、RVs／Yokohama.JPN／42.18／2［1E-L2］、RVi／Zhejiang.CHN／38.19／1［1E-L2］）属同一分支，同源性最高（平均核苷酸遗传距离p-distance 为0.004）；而与2018 年以前国内外流行的1E 基因型风疹病毒株亲缘性关系较远。见图4。

图4 2019 年辽宁省风疹病毒分离株与1E 基因亚型参考株基于E1-739 bp序列构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province and 1E gene subtype reference strains based on E1-739 bp sequence

2.4 2019年辽宁省风疹病毒分离株氨基酸变异位点分析 基于风疹病毒E1基因的739 bp基因片段推导的246 个氨基酸序列（aa159 ～aa404）与中国风疹BRD-Ⅱ疫苗株对比分析显示，2019 年辽宁省风疹病毒分离株共出现6 个变异位点，分别位于aa181（1株）、aa202（1 株）、aa241（1 株）、aa283（1 株）、aa333（17 株）、aa398（1 株）位点。所有风疹病毒分离株aa333 位点均出现丙氨酸→苏氨酸（A→T）变异；仅1株风疹病毒分离株（RVi／Liaoning.CHN／4.19／1［1E］）于aa283 位点出现谷氨酰胺→赖氨酸（Q→K）变异，此位点为E1 蛋白的抗原表位；其他毒株在N-型糖基化位点、血凝抑制位点和中和位点等重要抗原位点均未发生变异。见图5。

续图5 2019年辽宁省风疹病毒分离株与BRD-Ⅱ疫苗株相比氨基酸变异位点分析Fig.5（Continued）Analysis of amino acid variation sites of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province compared with BRD-Ⅱvaccine strains

3 讨论

辽宁省自2010 年起将风疹疫苗纳入扩大免疫规划，实行8 ～12月龄接种第1剂次和18 ～24月龄种第2剂次的免疫策略，全面实施2剂次风疹疫苗常规免疫后，疫苗免疫覆盖率一直维持在95%以上的高水平。随着含风疹类疫苗的有效接种，近10 年辽宁省风疹发病率呈逐年下降趋势，从2011年的24.756／10万下降至2017年的历史最低水平（0.023／10万）。但由于风疹易感人群的积累和输入性病毒的持续传播，导致2019 年发病率回升（0.927／10 万）［11］，国内外如中国北京、广州和日本等地均报道2019 年风疹发病率有所增加［12-15］。风疹发病呈明显季节分布特征，5 — 6 月发病率最高，之后呈明显下降趋势，符合呼吸道传染病的流行特点。2019 年，辽宁省14个城市均有风疹病例报告，其中沈阳市由于人口密度大和流动性高等原因风疹发病率最高达3.547／10 万。15 ～19 岁青少年是目前辽宁省风疹发病的主要人群，这与青海省、浙江省、山东省等多省份报道的流行形势基本一致［3，16-18］，大大增加了CRS 的潜在风险。

据ZHU 等［19］报道，我国流行风疹病毒共发生3次基因型间的更替，2001— 2002 年风疹流行期间，由1E-L1 基因亚型取代1F 基因型成为2002 年后我国风疹流行的优势基因亚型；随着2B-L1 基因亚型自2011 年输入并在我国持续流行，1E-L1 在我国的检出比例逐年降低，2015—2016 年间被2B-L1 基因亚型取代，同时我国风疹发病率在2017 年也达到历史最低水平；2018 — 2019 年间，2B-L1 基因亚型转换为1E-L2和2B-L2c基因亚型，又完成了1次基因亚型间的更替［8-9］。本研究于2019 年从辽宁省7 个地市暴发和散发病例中共分离到55 株风疹病毒株，系统进化分析表明，全部风疹病毒分离株均属于1E-L2基因亚型，与2018—2019 年间中国（湖南、香港、吉林、浙江）及日本流行的5 株1E-L2 基因亚型风疹病毒参考株（RVs／Changsha.CHN／51.18／1［1E-L2］、RVs／HongKong.CHN／25.19［1E-L2］、RVi／Jilin.CHN／13.19／2［1E-L2］、RVs／Yokohama.JPN／42.18／2［1E-L2］、RVi／Zhejiang.CHN／38.19／1［1E-L2］）核苷酸序列聚集成簇，核苷酸序列同源性为99.051% ～99.864%，氨基酸序列同源性为98.780% ～100%。1E-L2 基因亚型风疹病毒主要在马来西亚和日本等国家流行，于2018 年1 月在中国广西壮族自治区首次被监测到，为境外输入性病毒，在中国很多省份也发生传播流行，是导致2018 年后中国风疹疫情回升的重要原因［8，19-20］。2019 年辽宁省风疹病毒分离株与中国风疹BRD-Ⅱ疫苗株对比分析显示，共出现6个变异位点，所有风疹分离株aa333 位点均出现A→T 变异，与江苏省2019 年报道的结果一致［9］。仅1 株风疹病毒分离株（RVi／Liaoning.CHN／4.19／1［1E］）于aa283位点出现Q→K 变异，此位点为E1蛋白的抗原表位。其他毒株E1 蛋白（aa159 ～404）上已知重要功能区N-型糖基化位点（aa209）、抗原表位位点（aa245 ～284）、血凝抑制和中和抗原表位位点（aa208 ～239）等重要抗原位点均未发生变化。吉林省、上海市等多省市报道2017 年之前1E 基因型风疹病毒株在aa338 位点发生相同突变亮氨酸→苯丙氨酸（L→F）［21-22］，辽宁省也报道过2007—2012年间发现全部1E 基因型分离株均于此位点发生相同突变［23］，而2019 年辽宁省风疹病毒1E 基因型分离株此位点未发现突变。辽宁省流行的1E 基因型风疹病毒的氨基酸序列相对高度保守，病毒抗原性稳定，现行风疹疫苗仍是控制风疹疫情的首选措施。

WHO宣布，至2030年，所有六大区域（包括非洲、美洲、东南亚、欧洲、东地中海以及西太平洋地区）“实现并维持消除风疹的目标”［3］。分子流行病学和系统进化分析被纳入WHO 风疹流行病学监测方案，作为消除阶段的相关指标，并作为追踪病毒传播链、确定感染源和确认疫苗相关病例的重要工具［2，24］。2019年辽宁省的404例风疹病例中，385例（95.297%）未接种过风疹疫苗或免疫史不详，多为儿童期未接受常规风疹疫苗接种。辽宁省需进一步加强风疹流行病学和病毒学监测，为了解病毒基因特征变化规律，及时比对风疹病毒疫苗株，了解抗原位点变异等提供依据，同时应根据现状制定更加切实有效的风疹疫苗免疫策略，特别是针对15 ～19 岁年龄组人群采取有效的补充免疫措施［25］，以减少青少年和成年人易感人群，降低育龄女性患CRS的风险，维持人群中风疹疫苗高免疫覆盖率，最终达到控制和消除风疹的目标。