有氧运动通过抑制TAK1-MAPK信号通路改善压力超负荷诱导的心肌重构

陈巧莹，蒋依娜，管璇，曾静静，吴连拼，李磊，胡云良

1.温州医科大学附属第二医院 临床检验中心，浙江 温州 325027；2.温州市泛血管重点实验室，浙江 温州 325027；3.温州医科大学附属第二医院 心血管内科，浙江 温州 325027；4.宁波市第二医院 心内科，浙江 宁波 315000

心肌重构被认为是心力衰竭临床病理过程的决定性因素。心肌梗死、心肌炎、压力负荷过重等均能导致心肌重构的发生[1]。横向主动脉缩窄术（transverse aortic constriction, TAC）是研究心肌肥厚和心力衰竭的常用实验模型，可用于心血管疾病机制的研究和治疗策略的开发[2-3]。长期的压力超负荷会导致心肌发生病理性改变，最终可能导致心力衰竭和猝死[4-5]。

转化生长因子-β-激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1, TAK1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可被各种病理性应激激 活[6]，其活性增加会加剧压力超负荷诱导的心肌重构[7]。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路响应异常刺激而激活[8]。TAK1是MAPK信号通路的上游激活因子。TAK1激活后可促进MAPK信号通路蛋白的过度磷酸化，加剧TAC诱导的病理性心肌肥厚[9]。运动训练已被证明能够改善病理性心肌重构[10-11]。在心脏缺血/再灌注损伤大鼠中，有氧运动可通过抑制MAPK信号通路来发挥心脏保护作用[12]。但有氧运动改善TAC小鼠的心肌重构是否与TAK1-MAPK信号通路的活性有关，仍需进一步的研究。本研究利用TAC手术构建心肌肥厚模型，研究有氧运动对心肌重构的影响及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组C57BL/6J小鼠，6～8周龄，体质量20～25 g，购自温州医科大学实验动物中心[实验动物许可证号：SYXK（浙）2018-0017]。所有小鼠都饲养在一个屏障设施中，光照周期为12 h，温度为23～26 ℃，相对湿度为50%～55%，自由进食和饮水。随机将小鼠分为4组：假手术+对照（Sham+ CON）组（n=10）、假手术+游泳（Sham+SWIM）组（n= 10）、TAC+对照（TAC+CON）组（n=15）、TAC+游泳（TAC+ SWIM）组（n=15）。

1.2 TAC模型建立将小鼠固定在恒温支架上，接受1.5%异氟醚麻醉，气管插管连接呼吸机，沿胸骨切开肋骨，在左颈动脉与头臂干之间开胸，暴露主动脉弓。将6-0尼龙缝合线穿过主动脉弓并与放置在动脉上的27 G缩窄针结扎在一起，然后快速取出缩窄针，闭合并缝合胸腔。待小鼠能自主呼吸后关闭呼吸机，拔除气管插管，将小鼠移动到加热垫上恢复。假手术（Sham）组不结扎主动脉弓，其余操作同TAC组。

1.3 运动训练方案Sham和TAC手术后1周，运动组小鼠进行游泳训练。游泳训练的过程如下：第1天游泳时间为10 min，之后每天递增10 min，直至达到90 min。随后每周运动5 d，每天90 min，运动训练共持续4周。

1.4 超声心动图检查4 周的游泳训练结束后，1.5%异氟醚麻醉小鼠，使用30 MHz超声探头对小鼠主动脉弓进行超声检查。调整超声探头的位置以获得主动脉弓缩窄处的脉冲多普勒图像，测量峰值血流速度（Vmax：m/s），并计算压力梯度[PW：mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）]。使用M型超声探头评估心脏几何形状和功能。将传感器降低到平行于左侧胸骨旁线的胸腔上，然后逆时针旋转30°。使用B模式成像获得心脏的长轴“矢状”视图，调整换能器的角度以观察心脏，切换到M模式，将M模式光标垂直于乳头肌水平的心室壁放置，保存图像，测量收缩期左心室内径（left ventricular internal diameter during systole, LVIDs）、收缩期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness during systole, LVPWs）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction, LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening, LVFS）。

1.5 组织取材4周的游泳训练结束后，称量并记录每只小鼠的体质量。超声检查后处死小鼠，取出心脏组织，放入预冷的0.9%氯化钠溶液中，挤压排出血液，滤纸吸干后称量，比较各组的心脏质量/体质量比（heart weight/body weight, HW/BW）。同时，分离双肺组织，称量双肺质量，比较各组肺质量/体质量比（lung weight/body weight, LW/BW）。部分心脏用于石蜡包埋，部分心脏用于冰冻包埋，部分心脏置于液氮中冻存。

1.6 TUNEL染色将小鼠心脏组织包埋在OCT冰冻切片包埋机中，使用冰冻切片机将组织切成5 μm厚的切片。切片室温放置20 min后，用PBS洗涤。将组织用4%多聚甲醛固定30 min并用PBS洗涤，按照TUNEL细胞凋亡试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）说明书进行染色。

1.7 蛋白质印迹（Western blot）法检测从心脏组织中提取和纯化总蛋白，随后通过BCA蛋白定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）测定浓度。通过SDS-PAGE分离40 μg总蛋白并转移至PVDF膜（美国Thermo Fisher公司）。5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，与相应的一抗于4 ℃孵育过夜。抗胶原蛋白（Collagen）I抗体（1:1000，ab260043）、抗Collagen III抗体（1:1000，ab184993）、抗Bax抗体（1:1000，ab32503）、抗Bcl-2抗体（1:1000，ab59348）、抗心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide, ANP）抗体（1:1000，ab189921）、抗脑钠肽（brain natriuretic peptide, BNP）抗体（1:1000，ab236101）均购自英国Abcam公司。抗c-Jun N-末端激酶1/2（c-Jun N-terminal kinases 1/2, JNK1/2）抗体（1:1000，9258）、抗TAK1 抗体（1:1000，5206）、抗p-TAK1抗体（1:1000，9339）、抗细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1 and 2, ERK1/2）抗体（1:1000，4695）均购自美国Cell Signaling Technology公司。抗p-JNK1/2抗体（1:1000，AP0276）、抗P38抗体（1:1000，A14401）、抗p-P38抗体（1:1000，AP0526）均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。抗p-ERK1/2抗体（1:1000，28733-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司。TBST洗涤后，加入二抗（1:5000）室温孵育 2 h，再次洗涤。使用带有Image LabTM软件的系统对信号进行可视化。

1.8 HE染色摘取的小鼠心脏用0.9%氯化钠溶液冲洗后，4%多聚甲醛固定过夜，随后石蜡包埋，切成5 μm厚的切片。切片脱蜡后，苏木素染色7 min，自来水洗去多余的染液后，分化液分化3 s，自来水冲洗，伊红染色2 min，洗去多余染液。随后脱水、透明、封片，最后在显微镜下观察。

1.9 Masson染色选取石蜡切片，常规脱蜡后，丽春红品红染液染色7 min，弱酸工作液清洗1 min，磷钼酸染液1 min，弱酸工作液清洗1 min，苯胺蓝染色5 min，弱酸工作液清洗1 min，随后脱水、透明、封片，最后在显微镜下观察。

1.10 统计学处理方法采用SPSS22 软件进行分析。所有数据均为正态分布，以±s表示。多组间比较使用单因素方差分析，然后进行Dunnett’s多重比较检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 有氧运动改善压力超负荷小鼠的心功能 Sham+CON组和Sham+SWIM组小鼠主动脉弓结构及压力梯度正常，差异无统计学意义（P＞0.05）；与Sham+CON组相比，TAC+CON组和TAC+SWIM组主动脉弓明显狭窄，压力梯度明显增加（均P＜0.05），且两组之间缩窄处血压差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。心脏M型超声检查结果显示，与Sham+CON组相比，TAC+CON组LVEF和LVFS显著降低，LVIDs和LVPWs显著升高（均P＜0.05）。运动训练后，TAC+ SWIM组LVEF、LVFS与TAC+CON组相比显著升高，LVIDs、LVPWs与TAC+CON组相比显著降低（均P＜0.05）。见图2、图3。与Sham+CON组相比，TAC+CON组HW/BW比值、LW/BW比值显著升高；有氧运动训练后，TAC+SWIM组HW/BW、LW/BW的比值显著低于TAC+ CON组（均P＜0.05）。见图4。

图1 TAC手术对小鼠主动脉弓的影响

图2 各组小鼠M型超声心动图

图3 各组小鼠超声心动图指标比较

图4 有氧运动后各组小鼠心肺体质量比变化

2.2 有氧运动改善TAC小鼠的心肌重构HE染色与Masson染色结果显示，与Sham+CON组相比，TAC+ CON组心肌细胞横截面积、心肌间质纤维化程度明显增加（均P＜0.05），心脏发生显著重构；有氧运动治疗后，TAC+SWIM组心肌细胞横截面积和心肌间质纤维化程度与TAC+CON组相比均减少（均P＜0.05）。见图5。

图5 有氧运动减轻TAC小鼠的心肌重构

Western blot结果显示，与Sham+CON组相比，TAC+CON组ANP、BNP、Collagen I和Collagen III蛋白表达水平显著增加（均P＜0.05）；有氧运动后，TAC+SWIM组ANP、BNP、Collagen I和Collagen III蛋白表达水平较TAC+CON组降低（均P＜0.05）。见图6。

图6 各组小鼠ANP、BNP、Collagen I、Collagen III蛋白表达水平

2.3 有氧运动抑制TAC术后诱导的心肌细胞凋亡TUNEL染色检测发现，与Sham+CON组相比，TAC+ CON组细胞凋亡水平明显增加（P＜0.05）；有氧运动后，TAC+SWIM组细胞凋亡水平与TAC+CON组相比明显降低（P＜0.05）。Western blot结果显示，与Sham+CON相比，TAC+CON组Bax表达增加，Bcl-2和Bcl-2/Bax比值降低（均P＜0.05）；而有氧运动后，TAC+SWIM组Bax表达水平较TAC+CON组降低，Bcl-2和Bcl-2/Bax比值增加（均P＜0.05）。见图7、图8。

图7 有氧运动抑制压力超负荷诱导的心肌细胞凋亡

图8 各组小鼠Bax、Bcl-2蛋白表达水平

2.4 有氧运动抑制TAK1-MAPK信号通路与Sham+ CON组相比，TAC+CON组p-TAK1、p-JNK1/2、p-ERK1/2和p-P38蛋白水平显著增加（均P＜0.05）；有氧运动后，TAC+SWIM组TAK1、JNK1/2、ERK1/2和P38蛋白磷酸化水平较TAC+CON组显著降低（均P＜0.05）。见图9。

图9 各组小鼠TAK1、ERK1/2、JNK、P38蛋白磷酸化水平变化

3 讨论

适当运动训练对心血管系统有积极作用，包括增强心肌收缩力、减少心血管疾病风险等。研究表明，长期有氧运动可以通过减少氧化应激损伤、抑制炎症反应和促进心肌细胞增殖而产生保护作用[13]。 例如，运动训练可通过逆转小鼠心脏中沉默信息转录调控因子1（silent information regulator of transcription 1, SIRT1）的下调，提高心肌的抗氧化能力来对抗心肌缺血/再灌注损伤引起的心室重构和心肌纤维化[14]。本研究表明，有氧运动可以有效减轻TAC诱导的心肌重构，并可能通过抑制TAK1-MAPK信号通路激活，减轻心肌细胞凋亡来发挥心脏保护作用。

本研究结果显示，与Sham+CON组相比，TAC+CON组小鼠LVEF和LVFS显著降低，心肌细胞横截面积和心肌间质纤维化增加，HW/BW和LW/BW增加，提示压力超负荷导致心脏发生重构。而有氧运动可以显著增加TAC小鼠的LVEF和LVFS，降低HW/BW和LW/BW比值，减轻压力超负荷诱导的心脏肥大。同时，Sham+CON组和Sham+SWIM组心脏功能无显著差异，表明适当的有氧运动不会对心脏造成损害。

心脏肥大刺激导致复杂但协调的信号通路被激活，例如MAPK、蛋白激酶C等重要信号通路。MAPK信号通路在介导心脏肥大的发展过程中起着重要作 用[15]。据报道，MAPK磷酸酶1（MAPK phosphatase-1, MKP-1）是MAPK信号通路的重要负调节因子，在体内和体外过表达MKP-1会抑制MAPK信号通路的三个主要分支，阻断压力过载诱导的体内肥厚和激动剂诱导的体外肥大，证明MAPK信号通路在心脏肥大中具有重要作用[16]。TAK1是MAPK家族的上游成员，在各种信号网络中有重要的信号转导作用。TAK1激活后，激活心肌细胞中的多个信号通路，包括MAPK信号通路和NF-κB信号通路[17]。研究表明，抑制TAK1-MAPK信号通路激活能够改善心肌重构。例如，含有F-box/WD重复序列的蛋白5（F-box/WD repeatcontaining protein 5, FBXW5）通过抑制TAK1和阻断MAPK信号通路改善病理性心脏肥大[18]。此外，在老年心肌梗死大鼠中，运动训练能够抑制MAPK信号通路改善心功能及冠脉微循环障碍[19]。本研究中，p-TAK1、p-JNK1/2、p-ERK1/2和p-P38蛋白表达水平在TAC手术后明显升高；有氧运动干预后，TAC+SWIM组TAK1、JNK1/2、ERK1/2和P38蛋白磷酸化水平明显低于TAC+CON组，表明有氧运动能够显著抑制TAK1-MAPK信号通路的激活。

心肌细胞凋亡是心肌重塑和心力衰竭的重要致病特征[20]。当细胞发生凋亡时，细胞基质取代坏死细胞，增加心肌间质纤维化，损害心肌收缩力，促进心肌肥大，最终导致心力衰竭[21-23]。有研究报道，有氧运动产生的miR-342-5p，通过靶向JNK2抑制心肌细胞凋亡来保护心脏免受心肌缺血/再灌注损伤[24]。我们检测了Bax和Bcl-2蛋白的表达水 平，发现TAC手术后Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2表达降低；有氧运动后TAC+SWIM组Bax蛋白表达水平较TAC+CON组降低，Bcl-2表达增加，表明有氧运动可以显著抑制心肌细胞凋亡。TUNEL染色发现心肌细胞凋亡指数在TAC小鼠中增加，在有氧运动后降低，进一步验证了有氧运动可以减少TAC诱导的细胞凋亡，保护心脏功能。

综上所述，本研究发现，有氧运动作为一种有益的非药物疗法，在一定程度上可以阻断TAK1-MAPK信号通路的激活，抑制心肌细胞凋亡，改善压力超负荷诱导的心肌重构。