褪黑素通过激活Nrf2抑制铁死亡改善随意皮瓣存活

楼承浩，卢颖枫，王健

1.温州医科大学附属第一医院 创面修复科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第一医院 手外科·周围神经外科，浙江 温州 325015；3.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035

随意皮瓣是骨外科、创面修复科重要的修复重建手段[1-2]。随意皮瓣手术方式相对便捷，然而，随意皮瓣的远端容易发生缺血再灌注损伤，导致皮瓣组织坏死[3]。铁死亡是一种特殊的细胞死亡模式，在导致缺血再灌注损伤影响组织存活起到一定作用[4]。目前对于抑制铁死亡的可能分子机制有了一定的研究，核红细胞因子2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）在减轻脂质过氧化抑制铁死亡上起到了关键作用[5]。抑制Nrf2可能会导致脂质过氧化物（lipid hydroperoxide, LPO）的积累和促进铁死亡相关的疾病发生[6]。褪黑素（melatonin, MLT）是一种由松果体分泌的激素，主要与调节人体昼夜节律相关，同时也具有极强的抗氧化能力和过氧化物自由基清除能力[7]。其不良反应少，安全性高，近年来大量研究表明MLT在免疫调节、抗衰老、保护心血管、抗肿瘤等多种疾病上都具有治疗作用[8-9]。为了进一步探讨MLT对皮瓣保护的机制，了解铁死亡对皮瓣存活的影响，在小鼠上设计一系列实验以探讨MLT是否可以通过抑制铁死亡从而减轻随意皮瓣的缺血再灌注损伤，促进随意皮瓣的存活。

1 材料和方法

1.1 材料成年雄性C57BL/6小鼠（18～20 g）由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（浙）2021-0020。麻醉后去除背部毛发。在小鼠背部设计1.5 cm×4.5 cm随意皮瓣，将皮瓣钝性分离。在皮瓣基部切断双侧髂腰动脉4-0医用缝线原位缝合。将小鼠随机分组，首先取20只小鼠随机分为对照组、MLT组。第二步联合使用Nrf2抑制剂ml385，取45只小鼠随机分为对照组、MLT组、MLT+ ml385组。自造模开始，对MLT组和MLT+ml385组小鼠腹腔内注射MLT 20 mg/kg，MLT+ml385组在给药前30 min腹腔内注射Nrf2抑制剂ml38530 mg/kg。对照组注射等量0.9%氯化钠溶液，连续7 d。

1.2 小鼠术后皮瓣形态学观察观察皮瓣的颜色、质地、弹性等以判断皮瓣存活情况。切取完整皮瓣组织，称重并记录为皮瓣湿重。烘箱中充分烘干记为皮瓣干重。使用干湿重变化计算各组皮瓣组织含水量，评估皮瓣水肿情况。

1.3 激光多普勒血流灌注（laser Doppler blood flow，LDBF）成像麻醉后用脱毛膏脱去新生毛发，用激光多普勒仪对小鼠背部血流信号进行扫描。使用moor LDI Review软件分析数据，评估皮瓣血流量及灌注强度。

1.4 免疫组织化学染色将皮瓣组织切片烘干脱蜡水化。使用兔二步法试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）染色。实验中所用一抗：caspase-3 （1:100）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2, SOD2）（1:100）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）（1:100）、CD34（1:100），梯度脱水后中性树胶封片。

1.5 组织HE及Masson染色染色前将切片脱蜡水化。按HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）及Masson染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）说明书步骤染色。梯度乙醇及二甲苯脱水后中性树胶封片。

1.6 皮瓣组织丙二醛（malonaldehyde,MDA）、脂质过氧化物（lipid peroxide,LPO）、组织铁（tissue iron,Fe）含量检测及谷胱甘肽（glutathione,GSH）检测使用提取试剂将各组小鼠中段皮瓣组织低温匀浆后离心取上清液用于后续检测。按说明书分别使用MDA检测试剂盒、LPO测试盒及组织Fe测定试剂盒、GSH检测试剂盒检测各组组织提取液中各种含量。

1.7 透射电子显微镜麻醉后迅速割取约0.5 mm× 1 mm×1 mm大的全层皮瓣组织块，2.5%戊二醛固定。1%锇酸后固定，醋酸铀溶液室温染色1 h。梯度丙酮脱水，放入包埋液包埋后在65 ℃烘箱聚合1～ 2 d。用玻璃刀切半薄切片，染色观察定位后，进行超薄切片，染色烘干后进行电镜观察。

1.8 蛋白质印迹（Western blot）检测提取各组皮瓣组织蛋白，经凝胶电泳、电转移和缓冲液封闭后用TBST清洗后，将膜浸润至一抗稀释液稀释的目标蛋白一抗中，4 ℃摇床上孵育过夜。实验中所用一抗：Nrf2（1:1000），铁结合蛋白轻链（ferritin light chain, FTL）（1:1000），血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）（1:1000），谷胱甘肽过氧化酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）（1:1000）。TBST洗去一抗，并将膜浸润至用TBST稀释的与种属对应的二抗中，室温慢摇床孵育1.5 h。将曝光液均匀滴至PVDF膜表面，使用化学发光显像仪成像。

1.9 统计学处理方法采用GraphPad Prism 8.4.2统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料用±s表示，两组比较采用t检验；多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采取LSD-t检验法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MLT促进小鼠随意皮瓣存活术后第3天，对照组小鼠随意皮瓣出现大面积淤斑，MLT组仅随意皮瓣远端散在分布部分淤点。术后第7天，对照组淤斑连接成片，组织发黑、干燥、皱缩变硬，坏死面积趋于稳定，而MLT组仅随意皮瓣远端存在少量坏死组织，在第3、第7天MLT组相比于对照组存活面积增加（均P＜0.05），见图1A-D。LDBF成像评估，MLT组较对照组小鼠皮瓣血流信号强度增高（均P＜0.05），富血流面积较大，其近端及周边可见少量新生血管进入皮瓣内，见图1E、图1F。对照组远端皮瓣明显水肿，而MLT组水肿程度较低，MLT组组织含水量较对照组减少（均P＜0.05），见图1G、图1H。HE及Masson染色结果显示，对照组小鼠皮瓣组织中胶原纤维排列不规则、疏松，小血管较少，MLT组胶原纤维排列密集有序，小血管数量多，见图1I、图1J。

图1 MLT促进小鼠随意皮瓣存活

2.2 MLT提高随意皮瓣的抗氧化能力并抑制铁死亡MLT组皮瓣中凋亡指标caspase-3的含量较对照组降低（P＜0.05），见图2A、图2B。MLT组CD34阳性小血管含量明显高于对照组，并且VEGF表达增加（P＜0.05），见图2C-F。MLT组抗氧化蛋白SOD2表达较对照组上调（P＜0.05），见图2G、图2H。MLT组MDA和LPO含量均较对照组降低（P＜0.05），见图2I、图2J。MLT组皮瓣中的组织Fe含量较对照组降低（P＜0.05），见图2K。MLT组较对照组增加了皮瓣组织中GSH含量（P＜0.05），见图2L。与对照组比MLT组Nrf2表达增加（P＜0.05），抗氧化蛋白HO-1的表达上调（P＜0.05），Fe转运蛋白SLC40A1的表达上调（P＜0.05），铁死亡的关键抑制酶GPX4含量增加（P＜0.05），见图2M-Q。2组小鼠皮瓣的缺血损伤区域发现线粒体膜密度增加，体积缩小，细胞核大小基本正常，但染色质减少，核仁缺失，符合铁死亡损伤的特征，见图2R。

图2 MLT提高随意皮瓣的抗氧化能力并抑制铁死亡

2.3 抑制Nrf2 拮抗MLT对小鼠随意皮瓣存活的保护作用与MLT组比，MLT+ml385组Nrf2下调（P＜0.05）、抗氧化指标HO-1下调（P＜0.05）、抗脂质过氧化指标GPX4下调（P＜0.05）、FTL下调（P＜0.05），见图3。

图3 抑制Nrf2逆转MLT减轻铁死亡的作用

3 讨论

随意皮瓣在设计时不涉及主要血供血管，仅通过蒂部毛细血管网及基底部渗血提供血运，在较长的随意皮瓣血运得到重建前皮瓣远端往往会由于血液灌注不足导致缺血损伤。MLT已被证明具有广泛的生物学特性，除了调节生物节律的作用，在抗凋亡、抗炎、抗氧化方面的作用被广泛研究[10-11]。本研究首先验证了MLT对小鼠随意皮瓣的存活具有保护作用，在组织形态学上表现为MLT增加了小鼠随意皮瓣第3天及第7天的存活面积，一定程度上恢复了随意皮瓣在第7天的血流灌注，促进了小血管生成和皮瓣组织结构的稳定，在病理生理上MLT通过促进小血管的再生，缓解了皮瓣组织中凋亡的发生，提升了皮瓣的抗氧化能力。随意皮瓣在缺血再灌注损伤后代谢失衡产生的过量活性氧（reactive oxygen species, ROS）被认为是导致皮瓣坏死的诱因之一。本研究结果证明MLT给药后不但上调了抗氧化蛋白的表达，并且提升了抗氧化小分子GSH的含量，进而提高了皮瓣组织抗氧化的潜力。并且MLT组MDA含量降低，提示MLT减轻了脂质过氧化水平最终促进了皮瓣存活。

为了深入探究MLT促进随意皮瓣存活的可能机制，通过扫描电镜观察到了随意皮瓣的坏死中存在铁死亡的发生，铁死亡的本质是一种由Fe介导的脂质过氧化损伤。铁死亡的主要机制，一方面是细胞内游离Fe离子异常积累，导致LPO的异常积累[12]；另一方面，GSH还原系统抗氧化能力代偿不足，无法及时清除LPO导致细胞死亡[13]。Fe代谢、氧化应激、脂质过氧化和表观遗传调控的紊乱都与缺血再灌注损伤中铁死亡的进展有关[14]。MLT在新生儿缺氧缺血性脑病模型中对铁死亡的发生具有抑制作用[15]。MLT在小鼠肾小管上皮细胞中可以缓解急性肾损伤后发生的铁死亡[16]。本研究MLT给药后随意皮瓣坏死区域的LPO水平降低、含量减少，说明MLT可能调节了不饱和磷脂和ROS之间的LPO反应。Western blot检测结果及组织GSH含量检测结果表明MLT给药后通过保护GSH抗脂质过氧化还原系统抑制了铁死亡。同时，对组织Fe含量测定及转Fe蛋白SLC40A1表达的检测提示MLT还促进了细胞内的游离Fe向细胞外转运调节了随意皮瓣中的Fe代谢。MLT可以通过抑制铁死亡促进随意皮瓣存活。

MLT 是抑制随意皮瓣铁死亡的潜在信号通路。目前研究发现的铁死亡调节通路包括TP53、NFE2L2、YAP1/YAP和WWTR1/TAZ等[13]。其中Nrf2在抑制铁死亡上具有多重调节作用。此前已有大量研究表明，MLT可以激动Nrf2发挥生物学功能，有研究发现MLT可以通过激活AKT/Nrf2通路抑制氧化应激，从而抑制公鸡Leydig细胞的凋亡[17]。本研究发现MLT给药后在皮瓣中Nrf2的表达水平显著提升。因此，MLT对铁死亡的抑制作用很可能是通过激活Nrf2而实现的。使用Nrf2的抑制剂ml385腹腔注射给药以抑制皮瓣中Nrf2生物活性[18]。ml385导致了GSH合成降低、利用GSH进行抗脂质过氧化能力减弱、LPO含量增加、组织Fe代谢活性降低、组织Fe含量上升，从各方面说明了ml385可以阻断MLT在皮瓣中对铁死亡的抑制作用。这些结果也表明MLT对于随意皮瓣铁死亡的抑制作用依赖于激活Nrf2及其下游包括xCT/GSH/GPX4还原系统和Fe代谢相关的信号通路，Nrf2通过参与调控铁死亡起到促进随意皮瓣存活的作用，但对于MLT如何在随意皮瓣中激活Nrf2仍需进一步探究。

本研究证明MLT可以促进小鼠随意皮瓣存活。铁死亡是影响随意皮瓣存活的因素之一，抑制铁死亡能够促进随意皮瓣存活；MLT可以通过激动Nrf2提高抗氧化能力，减轻脂质过氧化并促进Fe代谢抑制铁死亡。但影响随意皮瓣存活的因素众多，机制复杂，仍需进一步深入的研究及探索。