刺槐素激活PPARγ/NF-κB 通路改善高糖/高脂应激所致血管内皮细胞功能失调的研究

甘璐，孙晓春，彭国平，张洁，熊绍风，饶毅

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006；3.江西应用科技学院，江西南昌 330100

糖尿病是当今世界三大疾病之一，其发病率及死亡率逐年上升，已成为各国关注的公众健康难题［1］。众所周知，糖尿病是一种体内呈现以高血糖为特征的蛋白质、糖、脂肪代谢等紊乱的综合性疾病，也是一种常见的慢性病［2］。正常的血管内皮细胞能够产生许多有益的细胞因子，达到维持血管的正常舒缩、抗血栓、抑制脂质聚积，抗炎等功能。当血管内过多的葡萄糖和脂质长期刺激内皮细胞时，会造成内皮细胞功能失常，这种失常也为糖尿病血管并发症的发生提供了始动因素［3］。

黄酮类化合物是有诸多药理作用的一类物质，通常具有抗肿瘤，抗炎，抗氧化，抗病毒等多种药理活性［4-7］。刺槐素（acacetin,ACA,5,7-二羟基-4'-甲氧基黄酮）是天然的黄酮类化合物，广泛存在于多种传统药用植物中，具有多种药理活性［8-12］。深入研究血管内皮细胞功能失调产生的相关病理机制或相关作用分子及药物是治疗代谢综合征的重要方向，也是提高患者的生活质量的重要方法，同时，糖尿病患者心脑血管并发症的发病率也会大大降低［13］。本研究从ACA 对高糖/高脂（HG/HF）应激下人体脐静脉内皮细胞（HUVECs）功能失常的保护作用及其相关机制出发，探究ACA 对HG/HF 应激HUVECs功能失常的保护作用。确认ACA 对HG/HF 应激诱导内皮功能失常的保护作用是否与PPARγ/NF-κB通路有关，为临床上治疗HG/HF 应激下的血管内皮细胞失常及周围血管病提供重要的实验依据。

1 材料

1.1 细胞株、培养基及血清

实验用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）株购自美国ATCC（Catalog No: CRL1730）；胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司。

1.2 试剂盒及试剂

人内皮素-1（ET-1）酶联免疫检测试剂盒（EK-M28801）、NO 检测试剂盒（R-1045）与凋亡试剂盒（G003-1-3）均购自南京建成科技有限公司；qRT-PCR 逆转录试剂盒（#22106-01）购自Tolobio公司；其他未详列试剂均购自北京Solarbio 公司。

1.3 主要仪器

680 型酶标仪（BIO-RAD，美国）；逆转录仪（BIO-RAD，美国）；PCR 仪（BIO-RAD，美国）；流式细胞仪（Beckman Coulter，美国）。

2 方法

2.1 HUVECs 细胞培养

细胞培养参照熊绍风［14］的细胞方法进行，用1%内皮细胞生长因子（ECGS）和10%FBS 含双抗（青霉素-链霉素）的DMEM 作为细胞培养基，细胞放置于37 ℃，含5% CO2的恒温孵育箱中培养。

2.2 划痕实验检测细胞愈合修复水平

HUVECs 以每孔2×105个接种于6 孔板中孵育，待细胞长至融合度为90%时，用200 μL 枪头沿着直线划细胞，然后弃去培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗三遍；后加入完全培养基；继续放入孵箱24 h，其中在0 h，24 h 时间点取出置于倒置显微镜下观察细胞愈合距离的变化并做好记录。

2.3 流式细胞仪测定HUVECs 细胞凋亡水平

根据试剂盒说明书要求，按步骤依次加入各种试剂，最后采用流式细胞仪测定。

2.4 硝酸还原酶法测定NO 含量

取细胞上清液至EP 管中，分为空白管、标准管和测定管。按照NO 试剂盒说明书配好试剂并加入到EP 管中混匀，37 ℃水浴60 min，最后取上清液进行后续操作；加入显色剂后混匀，室温静置10 min，用酶标仪在550 nm 下测定吸光度值。

2.5 qRT-PCR 检测PPARγ/NF-κB 通路mRNA

用胰岛素（100 nmol/L）处理30 min，去除细胞上清液，采用Trizol 法提取各组细胞RNA，用qRT-PCR逆转录试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，PCR 扩增体系为20 μL，其中cDNA 为2 μL，上下游引物各0.8 μL，PCR 循环数为39，95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸32 s［15］，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.6 ELISA 法检测细胞上清液ET-1 水平

按说明书步骤用标准溶液建立标准曲线，样品准备，封闭，上一抗二抗，加显色剂显色，最后用酶标仪测定吸光度，代入标准曲线中计算样品的ET-1 含量。

2.7 实验分组

2.7.1不同浓度ACA 对HUVECs 细胞活力的影响将HUVECs 细胞均匀接种于培养皿，随机分为七组，即Ctrl 组（加入正常培养基），ACA（浓度为5、10、20、40、80、160 μmol/L）组。

2.7.2ACA 对HG/HF应激下HUVECs细胞损伤的影响将HUVECs 细胞均匀接种于培养皿，随机分为四组，即Ctrl、HG/HF（44/1.0 mmol/L）、ACA（40 µmol/L）、HG/HF+ACA（40 µmol/L）组。

2.7.3PPARγ/NF-κB 通路抑制剂逆转ACA 对HG/HF应激下HUVECs 细胞损伤的修复作用将HUVECs细胞均匀接种于培养皿，随机分为五组，即Ctrl、HG/HF（44/1.0 mmol/L）、ACA（40 µmol/L）、HG/HF+ACA（40 µmol/L）、HG/HF+ACA（40 µmol/L）+T0070907（10 µmol/L）组。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 不同浓度ACA 对 HUVECs 细胞活力的影响

图1 结果显示：当ACA 浓度大于或等于80 μmol/L时，细胞活力显著下降（P<0.01），呈现出明显的细胞毒性，因此确认药物安全浓度范围为小于或等于40 μmol/L，同时选择40 μmol/L 作为实验最适浓度。

图1 不同浓度ACA对 HUVECs 细胞活力的影响

3.2 ACA 对HG/HF 应激下HUVECs 细胞损伤的影响

根据分组要求处理细胞24 h 后，检测ACA 对HUVECs 细胞损伤的影响，同时检测ACA 对HUVECs细胞PPARγ/NF-κB 通路的影响。

3.2.1ACA 对HG/HF 应激下HUVECs 细胞愈合率的影响如图2 所示，HG/HF 组的细胞愈合率相比于Ctrl 组显著下降（P<0.01），然而加入HG/HF+ACA的实验组细胞愈合率比HG/HF 组明显提高，与正常组的愈合率接近。

图2 ACA对HG/HF应激下HUVECs细胞愈合率的影响：A.细胞划痕图；B.细胞迁移率

3.2.2ACA 对HG/HF 应激下HUVECs 细胞凋亡率的影响如图3 所示，HG/HF 组的细胞凋亡率相比于Ctrl 组显著升高（P<0.01），然而加入HG/HF+ACA的实验组细胞凋亡率比HG/HF 组明显降低，与正常组的凋亡率接近。

图3 ACA对HG/HF应激下HUVECs细胞凋亡率的影响：A.细胞凋亡图；B.细胞凋亡率

3.2.3ACA 对HG/HF 应激下HUVECs 细胞ET-1、NO含量的影响如图4 所示，ACA 可以逆转由HG/HF应激介导的ET-1 含量的增加和NO 含量的减少。

图4 ACA对HG/HF应激下HUVECs细胞ET-1、NO的影响：A.ET-1含量；B.NO含量

3.2.4ACA 对HG/HF 应激下HUVECs 细胞PPARγ/NF-κB 通路mRNA 的影响如图5 所示，HG/HF应激能显著降低PPARγ 和NF-κB 的mRNA 表达，而在ACA 的加入下，PPARγ 和NF-κB 的mRNA表达显著增加。

图5 ACA对HG/HF应激下HUVECs细胞PPARγ/NF-κB通路mRNA的影响

3.3 T0070907 逆转ACA 对HG/HF 应激下HUVECs细胞损伤的修复作用

根据分组要求，处理细胞24 h 后，检测PPARγ/NF-κB通路抑制剂参与下ACA对HG/HF应急下HUVECs 细胞损伤的影响。

3.3.1对PPARγ/NF-κB 通路mRNA 的影响如图6所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制剂的加入能够明显抑制PPARγ 和NF-κB 的mRNA 的表达。

3.3.2对HG/HF 应激下HUVECs 细胞愈合修复作用如图7 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制剂的加入能够明显抑制ACA 对HG/HF 应激下HUVECs 细胞愈合的修复作用。

图7 对HG/HF应激下HUVECs细胞愈合修复作用：A.细胞划痕图；B.细胞迁移率

3.3.3对HG/HF 应激下HUVECs 细胞凋亡的修复作用如图8 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制剂的加入能够明显抑制ACA 对HG/HF 应激下HUVECs 细胞凋亡的修复作用。

图8 对HG/HF应激下HUVECs细胞凋亡的修复作用：A.细胞凋亡图；B.细胞凋亡率

3.3.4对HG/HF 应激下HUVECs 细胞ET-1、NO 含量的影响如图9 所示，PPARγ/NF-κB 通路抑制剂的加入能够明显抑制ACA 对HG/HF 应激下HUVECs细胞ET-1 含量的减少和NO 含量的增加。

图9 对HG/HF应激下HUVECs细胞ET-1、NO的影响：A.ET-1含量；B.NO含量

4 讨论

高脂血症、糖尿病等代谢性疾病与血管功能障碍密切相关，并加速着血管功能障碍的进展，同时血管功能障碍也增加心脑血管疾病患病几率［16］。血糖慢性增高则是糖尿病最显著的特征，且随着病情的进展，会导致一系列并发症（如视网膜病变、周围神经病变、糖尿病肾病、糖尿病足及周围血管病变等）的发生，给患者的日常生活及身心健康带来了严重的影响［17-19］。高血脂是导致糖耐量发生异常的一个危险促进因素。长期高血糖合并高血脂，将给机体的正常代谢带来严重损害，使得患者并发症的发生率显著升高［20］。已有研究证实HG/HF 可以诱导HUVECs 细胞功能失常［21］，因此，明确HUVECs 细胞功能失常的作用机制对防治包括糖尿病血管并发症和动脉粥样硬化等疾病有重要意义。

有研究证实，ACA 可以通过抑制细胞内氧化应激和ERS 来保护RINm5F 胰岛β 细胞免受脂毒性介导的胰岛损伤，且ACA 对胰岛细胞的保护作用可能与CHOP 介导的凋亡途径密切相关［22］。网络药理学和分子对接技术预测了ACA 作用的潜在靶点为TNF-α，信号通路为IKKα/β-NF-κB，并阐明了ACA 可通过抑制HG 诱导的NF-κB 入核和转录活性的异常升高，降低TNF-α 水平以此改善HG 诱导IR［23］。

本研究从NO 含量、ET-1 含量、细胞愈合率和细胞凋亡率四个方面探究ACA 对HG/HF 应激造成的HUVECs 细胞功能失常的修复作用，并且发现其修复作用机制可能是通过激活PPARγ/NF-κB 通路实现的，为研究高糖高脂引起的内皮细胞功能失常提供了新靶点，同时，为临床上治疗动脉粥样硬化等血管内皮失调性疾病提供了理论依据。但由于实验条件的局限性，本研究仅在细胞水平证明了ACA的作用，接下来我们将从动物实验方面进行进一步验证。