串联质谱法检测苯丙氨酸和酪氨酸在新生儿苯丙酮尿症诊断中的应用价值
2023-06-16刘宝峰卢甜甜
刘宝峰，卢甜甜
（孝感市妇幼保健院1.检验科2.儿童康复科，湖北 孝感 432100）
苯丙酮尿症是一种最为常见的遗传代谢性疾病，以血苯丙氨酸浓度升高为主要临床特征，主要由苯丙氨酸代谢途径中的酶缺陷引起，所缺陷的酶包括苯丙氨酸羟化酶或其辅酶四氢生物蝶呤[1]。苯丙酮尿症常表现为常染色体单基因隐性遗传，是临床最为常见的一种氨基酸代谢病。苯丙酮尿症患儿可出现头发由黑变黄、皮肤颜色变浅、体液（尿液、汗液）有鼠臭味等表现。患儿年龄增大后会逐渐出现智力发育落后，且年龄与其程度成正比[2]。苯丙酮尿症新生儿出生后，相较于健康新生儿不存在明显差异，部分患儿仅会出现喂养困难、睡眠不安，难以将其病情与苯丙酮尿症相联系。加强对新生儿苯丙酮尿症的筛查具有重要的临床意义[3]。串联质谱法是一种灵敏度、特异度均较高的检测方法。早在20 世纪90 年代，就有研究者将串联质谱法应用于新生儿遗传疾病的筛查中。串联质谱法应用期间，对于多种目标化合物的检测可同时进行，可在提高多种遗传代谢性疾病检出率的同时，降低假阴性检出率、假阳性检出率，从而提高检查结果的准确性，保障患儿及时接受治疗，避免其出现较为严重的后遗症[4]。基于此，本研究主要分析串联质谱法检测苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）在新生儿苯丙酮尿症诊断中的应用效果。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本研究对象为2016 年至2021 年期间于孝感市妇幼保健院行苯丙酮尿症筛查的新生儿218 420 例，其中有初筛阳性新生儿1352 例。另选取同期于该地区出生的500 例健康新生儿作为对照。500 例健康新生儿中有男性新生儿215 例，女性新生儿285例，占比分别为43.00%、57.00% ；日龄3 ～7 d，平均日龄（4.32±0.12）d。1352 例初筛阳性新生儿中有男性新生儿668 例，女性新生儿684 例，占比分别为49.41%、50.59% ；日龄4 ～7 d，平均日龄（5.21±0.08）d。两组的以上资料相比，P＞0.05。
1.2 诊断标准
采用干滤纸血片检测500 例健康新生儿的Phe、Tyr 浓度后，确定检测指标线性范围。阳性检测值：Phe ＞120 mol/L，Phe/Tyr ≥3.5。若 新 生 儿 检 测结果达到阳性标准，则给予复查，结果若仍表现为Phe ＞120 mol/L，Phe/Tyr ≥3.5，可诊断为新生儿苯丙酮尿症阳性[5]。
1.3 研究方法
根据检测后健康新生儿的Phe 和 Tyr 浓度确定Phe 和 Tyr 的线性范围，方法：在健康新生儿足跟处采集血样，收集血样采用专用滤纸，将此滤纸放到常温下自然风干，置于收集袋中。将收集袋置于-20 摄氏度温度下保存。在7 d 内采用串联质谱法实施检测，方法：取用采血滤纸制成的圆形滤纸（直径3 mm），将其置于96 孔板中。取甲醇溶液，应用Phe 和 Tyr同位素标记后加入至孔板中。密封后室温下离心处理，离心机转速：700 r/min，离心处理时间45 min。静置0.5 h 后，取80 μL 置于另一个96 孔板中检测。检测仪器应用美国 WATERS 公司生产的串联质谱仪及相关试剂盒，Phe标准品、Tyr 标准品及相应质控品购于美国 PE 公司。检测期间仪器参数设置：进样量每次20 μL，检测模式：多反应模式，每次检测时间3 min[6]。
1.4 观察指标
（1）计算Phe、Tyr 线性范围、浓度平均回收率、变异系数（CV）。（2）计算苯丙酮尿症阳性新生儿的Phe、Tyr 水平和Phe/Tyr。
1.5 统计学分析
本研究采用SPSS 25.0 版软件进行统计学分析，采用ChemoView 1.0 软件进行定量分析，以±s表示计量资料。经正态性检验与方差齐性检验后，正态分布且方差呈齐性的计量资料，两组间比较行LSD-t检验，组内比较行单样本t检验，偏态分布的数据用秩和检验；以n(%) 表示计数资料，行χ² 或Fisher检验；P＜0.05 表示数据差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Phe 和Tyr 线性范围、回收率及CV
线 性 范 围：Phe 为（26.32 ～891.12）mol/L，Tyr 为（38.96 ～265.22）mol/L。浓度平均回收率：Phe 为98.0%，Tyr 为97.3%。批内 CV：Phe 为3.9%，Tyr 为4.1%。批 间 CV ：Phe 为4.6%，Tyr 为5.7%。见表1。
表1 Phe 和 Tyr 线性范围、回收率及 CV
2.2 经串联质谱法检测结果
经串联质谱法检测发现，1352 例初筛阳性新生儿中有阳性患儿14 例，其Phe、Tyr 水平、Phe/Tyr 见表2。
表2 苯丙酮尿症阳性新生儿的Phe、Tyr 水平及Phe/Tyr
3 讨论
苯丙酮尿症是遗传代谢性疾病的常见类型。据调查，在全球范围内，苯丙酮尿症的发病率约1/1.5 万[7]。此病属于常染色体隐性遗传疾病[8]。此病患儿的肝脏中缺乏Phe 羟化酶，使其血液中Phe 及代谢产物的浓度明显高于健康新生儿。这能够引发脑神经损伤，使患儿在智力发育方面与同龄儿童相比明显落后[9]。加强新生儿苯丙酮尿症的筛查具有重要的临床意义。研究发现，检测新生儿血液中Phe 的含量对筛查苯丙酮尿症具有重要临床意义，可指导诊断及治疗[10]。目前，临床上常用的相关检测方法包括比色法、荧光法、高效液相色谱法、串联质谱法等。其中，以串联质谱法最为常用。相较于其他检测方法，将串联质谱法应用于新生儿苯丙酮尿症诊断中，假阳性率、假阴性率均可明显降低，检测耗时短，无需重复、大量采血[11]。新生儿苯丙酮尿症确诊后，应及时采取有效治疗措施，目的在于降低患儿血液Phe 浓度，避免其神经系统发育受到严重影响[12]。采取的治疗措施主要包括营养治疗、药物治疗、基因治疗、肝细胞抑制治疗。研究显示，可通过调节饮食控制苯丙酮尿症病情的发展[13]。过去，临床上常采用营养疗法对苯丙酮尿症患儿进行治疗（主要采用限制饮食中Phe 摄入量的方法）。有研究指出，对苯丙酮尿症患儿进行饮食治疗，会加重患儿家庭的负担，且治疗依从性无法保证，因此临床上多改用药物疗法治疗此病。在新生儿苯丙酮尿症药物治疗中，使用的药物主要为沙丙蝶呤[14]。沙丙蝶呤是Phe 辅酶四氢生物蝶呤的药物形式。其药理作用在于提高Phe 羟化酶缺乏患儿体内Phe 羟化酶的活性。研究发现，应用沙丙蝶呤治疗苯丙酮尿症可降低患儿血液中Phe 的浓度[15]。据调查，有1/4 ～1/2 的苯丙酮尿症患儿（缺乏Phe 羟化酶）经沙丙蝶呤治疗后效果理想[16]。另有部分患儿在服药期间即使摄取正常食物，其血液Phe 浓度的控制效果仍较为理想。在进行上述治疗的同时，为了解决患儿营养物质缺乏的问题，应及时给予营养素补充治疗，其中包括糖巨肽、中性氨基酸。前者是一种乳酪乳清蛋白，Phe 含量低，补充可满足身体所需。有研究指出，为苯丙酮尿症患者补充糖巨肽，既可以减少肠道有害菌数量，还可以使短链脂肪酸含量增加，且不会对肾功能造成影响。研究发现，在苯丙酮尿症的远期并发症中，骨脆性增加较为常见。经补充糖巨肽的苯丙酮尿症患者骨脆性增加的发生风险明显降低[17]。中性氨基酸是一种复合物，包含多种人体所需氨基酸。为苯丙酮尿症患者补充中性氨基酸可降低其血液中Phe 的含量，且不会增加其脑内Phe 的含量，从而可避免其脑功能受损[18]。本研究的结果显示，Phe 和 Tyr 的线性范围、回收率及CV 如下：线性范围：Phe 为（26.32 ～891.12）mol/L，Tyr 为（38.96 ～265.22）mol/L。浓度平均回收率：Phe 为98.0%，Tyr 为97.3%。批内 CV：Phe 为3.9%，Tyr 为4.1%。批间 CV：Phe 为4.6%，Tyr 为5.7%。经串联质谱法检测发现，1352 例初筛阳性新生儿中有阳性患儿14 例，其Phe 水平为431.28 ～621.05 mol/L，Tyr 水平为86.35 ～156.31 mol/L，Phe/Tyr 为3.9 ～5.9（均＞3.5）。这充分证实，新生儿苯丙酮尿症诊断中应用串联质谱法检测Phe、Tyr 浓度，具有线性范围宽、浓度回收率高的优势，临床应用价值较高。
