艾条熏蒸对猪肺炎支原体消毒效果的研究

贺宇文，黄勇，周汝顺，李剑锋，陈福华，李艳平，刘芬，周宇骏，李裕※

（1.湖南省兽药饲料监察所，湖南 长沙 410006；2.宁乡市动植物疫病预防控制中心，湖南 宁乡 410600；3.湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009；4.湖南中科基因技术有限公司，湖南 长沙 410205）

猪喘气病是一种猪场常见的疾病。猪喘气病的病原微生物是猪肺炎支原体。治疗猪喘气病可使用支原体敏感的抗生素，但由于治疗周期较长，易产生耐药，往往治疗效果一般。预防猪喘气病可使用灭活疫苗或弱毒疫苗，但由于抗原靶位多且难以激活细胞免疫等多种因素，不能实现完美的免疫效果。猪场一旦有喘气病的发生，很难根除，严重影响猪场生产效益。目前，猪场对猪喘气病的防控是将疫苗接种、抗生素治疗、环境消毒、淘汰阳性猪这四种手段联合使用[1-2]。环境消毒是防控猪喘气病病原体传播的一个重要的环节。艾条熏蒸是我国传统中医的一种空气消毒方法。艾条熏蒸的优点是容易实施，可以带猪消毒，成本低。有研究表明艾熏对某些细菌和病毒有较好的消毒效果[3-4]，并且发现艾熏消毒在某些方面优于紫外消毒[5-7]。因此，我们通过艾熏试验来检测艾熏对环境中猪肺炎支原体的消毒效果。

1 材料与方法

1.1 材料

猪肺炎支原体CD013 株，分离自湖南省常德地区某猪场。

自配KM2 液体培养基：10 g /L 水解乳蛋白Hank's 液400 mL；DMEM400 mL；猪血清200 mL；酵母浸液10 mL；青霉素200 IU/mL；酚红4 g/L；pH值调至7.6。

200 μL、1000 μL research plus 可调移液器（可整支高压灭菌），德国Eppendorf 公司出品。

定量分析滤纸，直径9 cm，高压灭菌。50 mL 具塞离心管，高压灭菌。0.45 μm 针头式细菌滤器。200 μL、1000 μL 移液器枪头，高压灭菌。生理盐水，高压灭菌。

1.2 试验分组

在某专业养猪场，选择相邻两栋猪舍的两个位置等同的栏舍，分成A、B 两组。

1.3 试验设计

在A组、B组栏舍的四个角交叉固定绳子，用绳子和夹子将滤纸悬挂在栏舍四角和中间位置，每个位置两张，滤纸底部离地面15~20 cm。共20 张滤纸。

将猪肺炎支原体CD013 株用KM2 液体培养基培养至饱和浓度。取饱和浓度的培养液，用无菌生理盐水10 倍稀释，充分混匀后，用移液器在放置好的每张滤纸上准确滴加250 μL。

A 组采用艾条熏蒸，熏蒸时间2 小时。B 组不熏蒸。

1.4 CCU 测定方法

熏蒸完成后，将每张定量分析滤纸取下，分别放置于50 mL 具塞离心管中，加入10 mL 无菌生理盐水浸泡、振荡10 分钟，用一次性注射器吸取约2 mL，用0.45 μm 细菌滤器过滤，得到20 份待测液，用于下一步操作。

每份样品取10 支无菌试管，分别加入1.8 mL KM2 液体培养基。用无菌枪头从待测液中吸取0.2 mL 混匀后的液体加入第1 支试管中，弃去枪头。另取一支无菌枪头将第2 支试管中的液体反复吹打均匀。第3 至第9 支试管按上述操作进行。第9 支试管充分混匀后吸取0.2 mL 液体弃去。第10 支试管只加入1.8 mL KM2 液体培养基作为空白对照管。盖上胶塞并用封口膜密封，37℃恒温箱孵育1周。第8 天观察试管中培养基的颜色变化情况，发生颜色变化的最高稀释倍数一管为被测支原体的浓度（CCU）。

2 结果与分析

从表1 中可知，未熏蒸的滤纸中，猪肺炎支原体的CCU 可达108或107。经过熏蒸1 小时的滤纸中支原体的CCU 大多为104或103，比未艾熏的对照组低3 个数量级或4 个数量级。结果表明艾熏对猪肺炎支原体有较好的杀灭效果。

表1 不同位置滤纸CCU 值结果

3 讨论

猪喘气病是猪场疫病难题之一，仍未被彻底解决。现已发现猪肺炎支原体能黏附猪肺上皮细胞、猪肾细胞、猪肺巨噬细胞等多种猪源细胞[8,9]；其脂膜蛋白对猪肺泡上皮细胞有抑制作用[10]；能对多种猪源细胞造成氧化损伤等[11]。猪肺炎支原体的致病机制仍需大量的科研工作进一步阐明。

面对猪喘气病的现实问题，我们从实用角度出发，设想将艾条熏蒸作为带猪消毒方法，对现有的防控手段进行有效补充。艾条熏蒸易于操作、安全有效，在医院和家庭都有着较广泛的应用[12,13]，但在畜禽养殖业中应用的报道不多。现代医学发现艾叶挥发油有很好的杀菌效果。有学者认为艾熏的消毒效果是由艾条燃烧生成的自由基中间体产生作用。宁佐伟等[14]尝试归纳分析艾烟的消毒机制，例如艾熏时弥漫于空气中的挥发油组分和产生的燃烟自由基对多种真菌（黑曲霉、青霉、白色念珠菌、白假丝酵母）、细菌（金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、奇异杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌）和病毒（甲型H3N2流感病毒、呼吸道合胞病毒）有抑制作用。本次试验艾熏的良好效果可能也是其挥发油组分和燃烟自由基的作用产生的，但具体机制仍有待明确。

此次试验的结果表明，艾熏对猪舍环境中猪肺炎支原体有较好的杀灭效果。艾条熏蒸在畜禽养殖行业有很好的应用价值。□