二氯异氰脲酸钠粉消毒剂能量试验研究

2023-06-15陈峰卢涛戴明清

湖南畜牧兽医 2023年2期

陈峰，卢涛，戴明清

（1.湖南五指峰生化有限公司，湖南浏阳 410331；2.湖南省浏阳市农业农村局，湖南浏阳 410300）

二氯异氰脲酸钠粉是目前畜禽消毒工作中常用的含氯消毒剂，广泛运用于畜禽养殖生产过程中。作为一种新型的内吸性杀菌剂，它适用范围广、高效且有强杀灭微生物作用，各种致病性微生物（如病毒、细菌芽孢、真菌等）很难在其水溶液中存活；且具环境适用性广，用量低残留少，性价比高等特点，主要用于禽舍、畜栏、器具及种蛋等消毒。为验证连续加入细菌悬液对消毒剂杀菌作用的影响，并测定该消毒剂用于多次消毒污秽物品或环境（含有机物较多），如用于畜禽栏舍、器具、运载车辆、种蛋等的实用剂量，特进行消毒剂能量试验，以供广大养殖用户参考。

1.材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 消毒剂：消毒威（二氯异氰脲酸钠粉，含有效氯20%），湖南五指峰生化有限公司出品（生产批号：20220701）。

1.1.2 细菌：大肠杆菌44103，金黄色葡萄球菌29213（湖南农业大学动物医学院提供）；蜡样杆菌芽孢CMCC（B）63303（上海鲁微科技有限公司），巴氏杆菌GDMCC1.803（广东环凯微生物科技有限公司）。

1.1.3 培养基：自配LB 液体培养基，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母粉5 g，调pH 值至7.4~7.6，煮沸3~5 min，滤纸过滤，121℃高压灭菌20 min。

1.1.4 中和剂：自配通用型中和剂（无水磷酸氢二钠2.83 g、磷酸二氢钾1.36 g、胰蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、葡萄糖2 g、硫代硫酸钠5 g、卵磷脂3 g、甘氨酸3 g、吐温-80 30 mL。将各成分加入到1L 蒸馏水中，待完全溶解后，调pH 值至7.2～7.4，于121℃高压蒸汽灭菌20 min，冰箱保存备用）。

1.1.5 稀释液：自配LB 液体培养基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化培养

取试验菌，置于37.5℃恒温培养箱中活化培养24 h，备用。

1.2.2 中和剂鉴定试验

试验菌为大肠杆菌，设计6 组，按悬液定量杀菌试验程序进行。试验分为6 组：①（消毒剂＋菌液）＋中和剂；②中和剂＋菌液；③（消毒剂＋中和剂）＋菌液；④消毒剂＋菌悬液；⑤菌液；⑥未接种的培养基。结果以第1 组不长菌或菌落数少于第2组，第2 组菌落数≥100 cfu/mL，第3、4、5 组菌落数在规定范围且组间菌落数误差≤15%，第6 组无菌生长，为所选中和剂组成及浓度适宜。

1.2.3 消毒剂能量试验[1]

(1)将制备的菌液进行活菌计数，然后用LB液体培养基稀释成含菌106～107cfu/mL 的试验菌液。

(2)将消毒剂样品配制成A、B、C 溶液，测试浓度分别为（以有效氯计）150、100、50 mg/L，各溶液取3 mL 分装于试管。

(3) 吸取1mL 试验菌液于3 mL 测试浓度A 的消毒剂溶液试管内。

(4)置20℃水浴中作用8 min。

(5)立即吸取上述菌药混合液50 μL，加入第一批5 支盛有5 mL 含中和剂的LB 培养基管中混匀，标记为1。

(6)在2 min 后再次吸取1 mL 试验菌液于3 mL测试浓度的消毒剂溶液试管内。

(7)置20℃水浴中作用8 min。

(8)立即吸取上述菌药混合液50 μL，加入第二批5 支盛有5 mL 含中和剂的LB 培养基管中混匀，标记为2。

(9)在2 min 后再次吸取1 mL 试验菌液于3 mL测试浓度的消毒剂溶液试管内。

(10)置20℃水浴中作用8 min。

(11)立即吸取上述菌药混合液50 μL，加入第三批5 支盛有5 mL 含中和剂的LB 培养基管中混匀，标记为3。

(12)分别吸取1 mL 试验菌液于3 mL 测试浓度B、C 的消毒剂溶液试管内，重复以上步骤。

(13)以LB 液体培养基代替菌液，同时进行上述各步骤，作为阴性对照组；以LB 液体培养基代替消毒液，同时进行上述各步骤，作为阳性对照组。

(14) 将以上各试管置于37.5℃恒温培养箱中48 h，观察是否有菌生长。

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 菌株的活化培养

根据结果可以数菌计算蜡状杆菌浓度约为3.5×1010cfu/mL，多杀性巴氏杆菌浓度约为3.1×1010cfu/mL，大肠杆菌浓度约为2.6×1012cfu/mL，金黄色葡萄球菌浓度约为2.2×1010cfu/mL，以此确定后续实验中菌种的稀释倍数（见图1）。

图1 四种不同菌种的梯度稀释涂板结果

2.1.2 中和剂鉴定试验

以含有效氯150 mg/L 的二氯异氰脲酸钠粉消毒剂溶液与大肠杆菌作用5 min 后加入中和剂作用10 min，结果表明通用型中和剂能有效中和消毒剂，且中和剂及中和产物无抑菌作用（见表1）。

表1 中和剂鉴定试验结果

2.1.3 能量试验

（1）能量试验对照组浑浊度

我们定义阳性对照组浑浊度为++（很浑浊），阴性对照组浑浊度为-（澄清），见图2。

图2 对照组浑浊度

（2）能量试验结果

结果见表2。

表2 能量试验结果

2.2 分析

供试样品消毒威（二氯异氰脲酸钠粉，含有效氯20%），在含有效氯150 mg/L 的浓度下，对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌的多次杀灭效果明显，各管澄清；对蜡状杆菌芽孢、大肠杆菌杀灭效果明显，仅在第3 次加入菌液出现浑浊；在含有效氯100 mg/L 的稀释倍数下，对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌杀灭效果明显，对蜡状杆菌芽孢、大肠杆菌具有一定的杀灭效果；在含有效氯50 mg/L 的浓度下，各样管均出现不同程度浑浊，杀灭效果不明显。试验中出现对不同菌种表达效果不同的原因可能是，不同菌种初始浓度不同，稀释过程中产生误差等。

3 讨论

试验结果表明，二氯异氰脲酸钠粉稀释液在含有效氯100~150 mg/L 浓度时，多次加入菌液后对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌杀灭作用明显，对蜡状杆菌芽孢、大肠杆菌具有一定杀灭作用；在含有效氯50mg/L 的浓度下，初次加入菌液对各试验菌的杀灭效果不确切。试验结果与文献报道的结果基本一致，但有差异[2,3]。产生这种结果的原因是有效氯浓度不同，本试验有效浓度为100~150 mg/L，与文献报道240 mg/L 相比偏低，因此对杆菌与芽孢类微生物杀灭效果较弱。考虑到对金属腐蚀性方面的影响[4]，低浓度的二氯异氰脲酸钠粉稀释液对金属器具、设备更友好，推荐在有效的前提下尽量使用低浓度消毒。