shRNA SIRT3基因对乳腺癌细胞MCF-7侵袭能力的影响及机制研究

王晓亮,郑 伟,赵 娜

乳腺癌是女性乳腺与甲状腺外科系统最常见的恶性肿瘤之一,研究[1]表明,近年乳腺癌的发病率和致死率明显升高。了解乳腺癌发生、发展的机制,寻求新的分子治疗靶点是乳房疾病研究领域的重要任务。乳腺癌的发生是一个长期过程,涉及大量基因及表观遗传的突变[2]。尽管已有大量研究[3-4]报道乳腺癌的相关发生及进展机制,但其详尽的分子机制尚未完全清楚。SIRT3基因在调节细胞增殖、分化与凋亡等生理过程中具有重要作用[5]。SIRT3基因作为沉默信息调节因子家族中的一员,主要定位于线粒体内膜,具有强大的去乙酰基作用,可参与调节能量代谢、细胞凋亡、肿瘤生长、抗衰老等活动[6-7]。然而尚未有研究涉及SIRT3基因在乳腺癌细胞中的作用特点。本研究探讨shRNA SIRT3在乳腺癌细胞中的表达及其对乳腺癌细胞的增殖与侵袭的影响。现作报道。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2021年于陕西省榆林市第一医院接受外科手术治疗且经术后病理检查证实的乳腺癌病人,病人术前均未采取放化疗、免疫治疗等其他治疗措施。乳腺癌组织和癌周组织均为术后获取的新鲜组织标本。

1.2 细胞培养与分组 人乳腺癌细胞系MCF-7细胞购自中科院上海细胞研究院。经离心收集后,以2×104/cm2密度种植于25 cm×25 cm的Thermo Scientific细胞培养瓶中。加入含10%胎牛血清(Gibco-BRL,美国)的DMEM培养液(Gibco-BRL,美国),取MCF-7细胞进行后续实验。按照处理方法的不同分为3组,即空白对照组(不转染慢病毒的乳腺癌MCF-7细胞组)、阴性对照组(乳腺癌MCF-7细胞转染无序序列慢病毒载体)和shRNA干扰组(乳腺癌MCF-7细胞转染shRNA SIRT3序列慢病毒载体)。以GFP为慢病毒荧光探针,用荧光显微镜观察细胞慢病毒的转染效率。

1.3 免疫组织化学染色 采用SP法,处理72 h后将乳腺癌组织和癌周组织进行蜡块切片、脱蜡;PBS洗3次,每次5 min;切片室温放置30 min;PBS冲洗3次,每次5 min;BSA室温处理10 min;加SIRT3一抗(Novus Biologicals,美国),4 ℃过夜;PBS冲洗3次,每次5 min;加辣根酶标记链酶卵白素液,孵育10 min;PBS冲洗3次,每次5 min;孵育AlexaFouor 488羊抗兔IgG二抗(Novus Biologicals,美国),室温放置20 min;PBS冲洗3次,各5 min;DAB显色4 min;苏木精复染2 min,倒置光学显微镜下镜检。

1.4 构建SIRT3的基因沉默质粒shRNA SIRT3 shRNA SIRT3的慢病毒沉默表达载体由上海吉凯公司合成,选择pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro作为质粒的克隆载体。shRNA SIRT3沉默表达载体的克隆切入点为XhoI/BamHI,编号为ENST00000001537。经过基因测序证明序列的正确性。

1.5 实时荧光定量PCR检测 3组细胞处理后,加入1 mL Trizol RNAiso(Takara,日本),提取总RNA,根据Takara逆转录试剂盒说明书,检测总RNA纯度,1.9～2.0为纯度良好。逆转录cDNA保存在4 ℃冰箱中备用。根据TaKaRa荧光定量PCR试剂盒说明书要求,采用20 μL反应体系,加入各样品。进行荧光定量PCR的检测。采用FS2000系统对PCR进行分析,反应条件预设为预变性:95 ℃ 30 s,1个循环。PCR:95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s,40个循环。溶解曲线:95 ℃ 5 s;60 ℃ 1 min。降温:50 ℃ 30 s,1个循环。内参基因GAPDH和LncRNA PCGEM1引物由上海生工公司生产(见表1)。采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。

表1 目的基因引物序列

1.6 Western-blotting检测 处理72 h后取3组细胞,加入1 mL RIPA细胞裂解液,各组细胞在冰上裂解30 min,收集入1.5 mL离心管中,在预冷4 ℃的离心机中5 000 r/min离心,5 min后提取上清,经95 ℃煮沸后,收集蛋白备用。按照说明书制备浓缩胶10 mL,分离胶20 mL。上样后电泳分离,转膜后在4 ℃冰箱避光孵育过夜(>12 h)。SIRT-3一抗经一抗稀释液1∶10 000稀释后加入样本离子膜。第2天用PBST稀释液洗膜,重复3次,加用山羊抗小鼠IgG二抗经二抗稀释液1∶1 000稀释后孵育二抗1.5 h,用PBST稀释液洗膜,重复3次,而后用DAB显影液处理样本。Image J软件分析蛋白条带。

1.7 Transwell小室实验检测细胞的迁移 3组细胞经胰蛋白酶消化后收集,按说明书要求,将基底膜的基质原液放在冷藏冰箱(4 ℃)过夜融化,然后与预冷的无血清的DMEM培养基按照1∶3比例配置侵袭上室凝胶液体,以每孔55 μL的量包被Transwell小室的上室,放置37 ℃孵育箱,2 h后使上室成胶。然后上室每孔接种200 μL不含血清的细胞培养液,下室加入10%胎牛血清的DMEM培养液500 μL。将Transwell板放置在37 ℃孵育箱中培养24 h后用结晶紫染色。然后将Transwell板用倒置光学显微镜,拍照,并进行细胞计数。所有实验均重复3次。

1.8 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色 乳腺癌组织和癌周组织的SIRT3免疫组织化学染色结果显示,肿瘤组织的SIRT3棕色染色明显强于癌旁组织。

2.2 3组SIRT3 mRNA、caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表达比较 shRNA干扰组SIRT3 mRNA相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)(见表2)。

表2 3组SIRT3 mRNA、caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA相对表达量比较

2.3 3组SIRT3、caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量比较 Western-blotting检测结果显示,shRNA干扰组SIRT3蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)(见表3)。

表3 3组SIRT3、caspase-3、caspase-9蛋白相对表达量比较

2.4 Transwell实验检测细胞迁移 shRNA干扰组迁移细胞数均明显少于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)(见表4)。

3 讨论

恶性肿瘤是威胁人类生存的重大公共卫生问题之一,寻求恶性肿瘤的治疗靶点具有十分重要的研究意义[8-9]。SIRT3基因与恶性肿瘤的侵袭性密切相关[10-11]。本研究构建shRNA-SIRT3慢病毒干扰载体,探讨shRNA-SIRT3对乳腺癌细胞的侵袭作用机制,为临床乳腺癌的治疗提供新的治疗靶点。

表4 3组Transwell实验检测细胞的迁移情况

caspase-3是一种蛋白酶,1994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表达序列标记(expression sequence tag,EST)数据库中找到一段与ICE/CED-3活性中心同源的序列,用它合成探针后,筛选人Jurkat T淋巴细胞cDNA文库,从中克隆到一种新基因,因其编码相对分子量为32 000的半胱氨酸蛋白酶而称之为CPP32[12-13]。本研究采用实时荧光定量PCR方法和蛋白水平Western-blotting方法,结果显示,shRNA干扰组SIRT3 mRNA和SIRT3蛋白相对表达量均明显低于阴性对照组和空白对照组,caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA及相应蛋白相对表达量均明显高于阴性对照组和空白对照组。提示shRNA-SIRT3在乳腺癌细胞的凋亡中具有明显作用,蛋白水平亦证实了shRNA-SIRT3在乳腺癌细胞的侵袭能力具有明显抑制作用。

肿瘤的侵袭能力是恶性肿瘤与良性肿瘤的重要区别[14],同时也是检验一种治疗方法针对恶性肿瘤的检验指标[15]。本研究采用Transwell试剂盒检测shRNA-SIRT3慢病毒干扰载体的侵袭能力,结果显示,shRNA-SIRT3慢病毒干扰载体可有效抑制人乳腺癌细胞的侵袭。

综上,shRNA-SIRT3的慢病毒干扰载体可促进人乳腺癌细胞的凋亡,抑制人乳腺癌细胞的侵袭。但本实验存在不足,如缺乏动物模型体内的检测,尚有待进一步研究证实。