PIK3R1在人原发性肝细胞癌中的表达及其与肿瘤上皮间质转化关系

姚 楠,孙景秋,郭冰沁,武世伍

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球五大恶性肿瘤之一,其死亡率位居全球恶性肿瘤的第二位[1],病人检测发现时往往已经是晚期,肿瘤发生转移。近年来针对肝细胞癌诊断和治疗的研究较多,但肝癌病人的总体预后仍然较差。肿瘤的侵袭和转移取决于多方面因素,上皮间质转化(EMT)及多种信号通路都参与其中,目前,针对EMT和PI3K/AKT信号通路之间的相互关系尚未完全阐明。本研究针对肝细胞癌中EMT相关蛋白转化生长因子β(TGF-β)、上皮性钙黏蛋白(E-cadherin)和PI3K/AKT信号通路中磷脂酰肌醇-3激酶调节亚单位1编码蛋白(PIK3R1/p85α)表达进行测定,并分析其相关性,以期为中晚期肝细胞癌治疗提供科学依据。现作报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010-2015年我院病理科80例HCC肿瘤组织和相应癌旁组织。其中男61例,女19例;年龄26～79岁。按照Edmondson-Steiner分级法分为四级,将其中Ⅰ～Ⅱ级定义为低级别,共33例,Ⅲ～Ⅳ级定义为高级别,共47例;大肝癌63例,小肝癌17例。所有病例均明确肝细胞癌病理诊断,并完善随访资料,行肝癌根治切除术前,未接受术前辅助化疗、放疗、靶向治疗或免疫治疗。

1.2 试剂 兔抗人单克隆p85α抗体(工作浓度1:100)、兔抗人多克隆E-cadherin(工作浓度1∶100)、兔抗人多克隆TGF-β抗体(工作浓度1∶100)均购自美国Santa Cruz公司,链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。PAS染色液为蚌埠医学院第一附属医院病理科配制。

1.3 方法 组织采用10%中性甲醛固定,石蜡包埋。4 μm切片,常规脱蜡、水化、3%H2O210 min阻断内源性过氧化物酶,高温高压修复10 rain,加入一抗后,按试剂盒说明书进行免疫组织化学染色操作。DAB显色,苏木精复染。采用已知阳性片作为对照组,以PBS代替一抗作为空白对照组。

1.4 结果判定 p85α蛋白均定位于细胞质,以颗粒状或片状着色棕黄色为阳性。E-cadherin主要定位于细胞膜,有时表现为细胞质和细胞膜均着色,染色呈棕黄色。TGF-β定位在细胞质中,染色呈黄色或棕黄色。采取二次计分法,每例标本随机选取10个高倍视野(×400),计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比计分。(1)按染色强度评分:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。(2)按阳性细胞百分比计分:阳性细胞数<10%为0分,阳性细胞数10%～30%为1分,>30%～50%为2分,>50%～75%为3分,>75%为4分。将两项得分结果相乘:≤1分为阴性,>1分为阳性。免疫组织化学标记结果由两位病理医师采用独立双盲法判定。

1.5 统计学方法 采用χ2检验和Spearman相关分析。

2 结果

2.1 PIK3R1/p85α在HCC及癌旁组织中的表达比较 PIK3R1/p85α在HCC组织中的阳性率为70.0%(56/80)(见图1),高于癌旁组织中的17.5%(7/40)(χ2=29.47,P<0.05)。

2.2 不同临床特征HCC病人PIK3R1/p85α和E-cadherin、TGF-β表达比较 不同组织分化程度HCC病人的PIK3R1/p85α、E-cadherin和TGF-β表达差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01),而不同性别和肿瘤直径病人的PIK3R1/p85α、E-cadherin和TGF-β表达差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 不同临床病理特征HCC病人PIK3R1/p85α、E-cadherin和TGF-β表达比较(n)

2.3 HCC组织中PIK3R1/p85α与E-cadherin、TGF-β表达的相关性 Spearman相关分析显示,HCC组织中PIK3R1/p85α与E-cadherin表达呈明显负相关关系(r=-0.323,P<0.01),与TGF-β表达呈正相关关系(r=0.247,P<0.05)。

2.4 HCC组织中PIK3R1/p85α表达与肿瘤侵袭转移的关系 将收集的病例分为无侵袭转移组(无脉管侵犯及随访无复发转移)66例和有侵袭转移组(有脉管侵犯或术后有复发转移)14例,结果显示,2组p85α蛋白表达差异有统计学意义(χ2=3.87,P<0.05)。

3 讨论

在我国,HCC发病率和死亡率均排在消化系统恶性肿瘤的首位。临床上发现时多为晚期,虽然近年来治疗手段多样化,但病人5年生存率仍较低。统计[2]发现,若肝细胞癌发生肝外转移,病人5年生存率仅为4%。肝癌预后差主要是因为肿瘤细胞易发生转移。肿瘤的转移机制与多种因素有关,其中肿瘤细胞的EMT及多种信号通路的参与是近期研究的热点。

EMT是指上皮细胞在特定条件下向间充质细胞转化的现象。在这个过程中上皮细胞骨架发生重排、细胞外基质重塑,形态从原来的上皮样转变为梭形或星芒状,排列上也从紧密黏附的铺路石样变为弥散性排列,随着黏附性降低,肿瘤细胞的运动和侵袭能力显著增强,从而更容易从原发病灶脱离,进入末梢血管或淋巴系统[3]。在此期间,肿瘤细胞会出现上皮细胞标志性蛋白表达减少,而间充质细胞标志性蛋白表达增加。现有实验[4]结果已证实,在肝细胞癌的侵袭转移过程中存在EMT,但其具体机制尚不明确。本实验中,我们选取已证实的EMT相关蛋白E-cadherin[5]和TGF-β[6]进行验证,发现在HCC组织中,不同组织分化程度病人的E-cadherin和TGF-β表达差异均有统计学意义。

三磷酸肌醇激酶作为一种细胞内的磷脂酰肌醇激酶,可以通过结合定位于质膜的受体而激活,并产生磷脂酞肌醇-3,4,5-三磷酸,其与蛋白激酶B结合,进而启动PI3K/AKT信号通路[7-8],调节肿瘤细胞的增殖和凋亡。作为PI3K的调节亚单位,p85亚基又是由p85α(PIK3R1)和p85β(PIK3R2)这两个密切相关的蛋白组成[9-10]。其中PIK3R1是PI3K信号通路的关键基因[11]。有研究表明,该基因和其编码的蛋白p85α,在多种恶性肿瘤如前列腺癌、肝细胞癌中,PIK3R1/p85α表达明显高于正常肝组织[12-13]。但PIK3R1与肝癌尤其是HCC侵袭转移之间的关系尚未完全阐明。有研究表明,PIK3R1的下调可以导致HCC细胞生长抑制,这可能与细胞周期G2/M期细胞停滞和细胞凋亡增强有关[14-15]。本组实验通过对80例HCC及癌旁组织进行p85α蛋白表达检测,发现HCC组织中PIK3R1/p85α表达高于癌旁组织,且不同组织分化程度HCC病人的PIK3R1/p85α表达差异有统计学意义。

目前,针对PIK3R1在肿瘤细胞EMT中的作用研究仍较少,尚未明确两者之间的作用机制,尤其在HCC中,其与肿瘤EMT之间的关系目前还是盲区。有研究表明,TGF-β可以通过调节肿瘤坏死因子受体相关因子6的活性激活PI3K/AKT信号通路。TRAF6可诱导p85多聚泛化,从而促进前列腺癌细胞的侵袭性[16]。本实验结果显示,HCC组织中PIK3R1与TGF-β表达呈正相关关系,与E-cadherin的表达呈负相关关系。

综上,HCC组织中PIK3R1过表达可能参与诱导EMT的发生,PIK3R1的上调与HCC的发生和恶性发展有关。