基于网络药理学和体内实验研究竹叶石膏汤治疗痛风性关节炎的分子机制*

刘万杰，翟伟林，刘文斐，邹家辉，张秋灵，黄各宁，梁艳坤

（1.广州市从化区中医医院，广东 广州 510999；2.广州开发区医院，广东 广州 510730；3.南方医科大学第五附属医院，广东 广州 510999；4.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510045）

痛风性关节炎（gouty arthritis，GA）的发病率逐年上升，其以尿酸盐和坏死组织为中心的痛风结节和纤维性血管翳造成受累组织炎症反应及肉芽组织形成等[1-2]。随着社会的发展，GA发病率逐年攀升，全球GA发病率为1%～15%[3]，GA带来的慢性疼痛、残疾及沉重的经济负担可导致焦虑、抑郁和自杀情绪。然而，长期服用非甾体抗炎药物及秋水仙碱的GA患者常出现胃肠道和心血管副作用[4-5]。晚期GA主要接受关节镜或关节置换手术，但手术费用高昂且术后并发症多[6]。目前，GA的发病机制尚不完全明确且治疗方式尚未达成共识。因此，有必要深入挖掘GA的发生、发展机制，并为GA的精准治疗提供新的理论依据及诊疗指南。

竹叶石膏汤目前主要用于治疗各种热证、小儿疾病、GA等疾病[7]。当前研究发现，竹叶石膏汤具有抗炎、解热、抗菌等功效[8]。此外，CHOI S等[9]研究发现，竹叶提取物可通过抑制氧化应激反应，抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达，从而发挥抗血管性炎症的作用。石膏主要成分为含水硫酸钙，能抑制骨骼肌的兴奋性，经胃酸消化后成为可溶性钙盐，可减少血管渗透性，抑制渗出液的形成[10-11]。ZHAO J W等[12]研究发现，麦冬提取物4-O-去甲基麦冬苷元E可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶信号传导，降低一氧化氮和炎症细胞因子的表达来发挥抗炎作用。YU T等[13]研究发现，人参皂苷Rc有显著的抗炎活性，可以通过靶向结合p38/激活转录因子-2（ATF-2）途径抑制炎症反应发生。另外，有研究[14-15]发现人参皂苷Rc还能抑制白介素-1β（IL-1β）处理的人软骨细胞中MMP-13的表达，从而起到保护软骨细胞的作用。而GA通过多种信号传导途径将胞外信号传递到胞内，进一步释放炎症因子、趋化因子介导免疫炎症反应[16]。因此，竹叶石膏汤可能具有较强的抗GA作用。故本研究通过网络药理学预测竹叶石膏汤的潜在药理作用机制及其与GA相关靶点和通路的相互作用，并通过动物实验进行验证。

1 资料与方法

1.1 网络药理学分析

1.1.1 竹叶石膏汤有效活性成分及筛选鉴定 将竹叶石膏汤的组成药物“竹叶”“生石膏”“半夏”“麦门冬”“人参”“甘草”“粳米”输入中药药理学系统数据库（TCMSP）[17]及BATMANTCM[18]进行搜索。生物利用度（oral bioavailability，OB）表示口服药物被吸收进入体内循环的速度和程度（包括药物的生物利用度及利用速度）。类药性（drug-likeness，DL）是一个基于现有药物的理化性质和分子结构的概念，用于评价某一化合物与已知药物的相似性。根据TCMSP/BATMAN-TCM数据库常见的筛选标准及结合以往文献结果[19-20]，选择OB≥30%和DL≥0.18，或Score cutoff≥20，校正P＜0.05的活性成分进行后续分析研究。

1.1.2 靶标蛋白筛选及药物-活性成分-靶点网络构建 利用TCMSP/BATMAN-TCM数据库对筛选得到的药物活性成分进行靶点查询，并将筛选所得所有靶蛋白名称导入DrugBank数据库（https:∥www.drugbank.ca/）及UniProt数据库（https://www.uniprot.org）。设置物种为人类（Homo sapiens），对得到靶蛋白进行比对和基因名校正，转换成标准的基因名，并删除无对应基因名的靶蛋白。得到的药物活性成分并与活性成分对应靶点建立对应关系。通过Cytoscape 3.7.2软件得到药物-活性成分-靶点交互作用网络模型[19-20]。利用Cytoscape 3.7.2软件中的“Network Analyze”功能进行网络拓扑学分析[21]，筛选得出核心活性成分及潜在靶基因。

1.1.3 GA基因表达谱获取 在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）及OMIM数据库（https://www.omim.org/）中下载与GA相关的基因，筛选条件：（1）痛风性关节炎；（2）人类；得到符合筛选标准的与GA相关的基因集。

1.1.4 药物活性成分-痛风性关节炎靶点交集及交互网络构建 利用在线韦恩图制作网站Interacti Venn[22]（http://www.interactivenn.net/）对药物活性成分靶点及疾病靶点中共同的靶基因进行韦恩图展示，将得到的共同靶基因导入在线分析网站STRING构建蛋白-蛋白互作网络[23]（protein-protein interaction，PPI）。利用Cytoscape 3.7.2软件中的BisoGenet插件[23]分别构建药物活性成分靶点PPI及GA相关PPI网络，利用Cytoscape 3.7.2软件中的“Network Analyze”功能进行网络拓扑学分析，将药物活性成分PPI和GA相关基因PPI网络进行合并，得到药物活性成分和GA相关基因共有PPI网络。利用Cytoscape 3.7.2软件中的CytoNCA插件对药物活性成分靶点与GA相关基因共有PPI进行多中心网络拓扑学计算，并根据Degree、中介中心性（betweenness centrality，BC）、紧密中心度（closeness centrality，CC）、局部平均连通度中心性（local average connectivity-based，LAC）、邻域连通性（neighborhood connectivity，NC）值的中位数值进行筛选，得出竹叶石膏汤活性成分作用于GA的潜在核心靶基因。

1.1.5 靶基因GO/KEGG富集分析 为进一步探讨竹叶石膏汤活性成分对GA的潜在作用机制及共同靶基因的功能，利用R语言中的Bioconductor包、clusterProfiler包对上一步得到的靶基因进行基因本体论（GO）和KEGG信号通路分析[24]。其中GO分析主要包括潜在靶基因的细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物学过程（biological process，BP）。同时利用pathview包绘制相应的信号通路图。

1.2 动物实验

1.2.1 实验动物 6周龄SPF级雄性Wistar大鼠36只，体质量（257.1±10.01）g，由广州中医药大学三元里校区动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0034。饲养于广州中医药大学SPF级动物房，温度为25 ℃，相对湿度为37%。本动物实验方案及伦理审查获广州中医药大学动物实验伦理审查委员会批准（编号：20211212008）。

1.2.2 药物与试剂 竹叶石膏汤，方药组成：竹叶6 g，生石膏50 g，半夏9 g，麦门冬20 g，人参6 g，粳米10 g，甘草6 g，由广州中医药大学第一附属医院提供并经唐洪梅主任中药师鉴定为正品；秋水仙碱片（批准文号：国药准字H20113208）购于广东彼迪药业有限公司；戊巴比妥钠（批号：811B025）购于北京索莱宝生物科技有限公司；尿酸钠溶液（批号：CW2567）购于广州市信洪贸易有限公司；荧光定量PCR试剂盒（批号：QP002）购于广州复能基因有限公司；TRIzol试剂（批号：DP424）、cDNA合成试剂盒（批号：KR202-02）购于北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 主要仪器 ST16型离心机（美国Thermo Fisher公司）；SpectraMax iD5型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；Veriti Dx型热循环仪（上海艾研生物科技有限公司）；StepOneTM荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技有限公司）；K5600型核酸微量分析仪（北京凯奥科技发展有限公司）。

1.2.4 造模与分组 通过简单随机分配法将36只大鼠分为空白组、模型组、秋水仙碱组、竹叶石膏汤组，每组9只；GA的急性动物模型参考改良的Coderre法[25]。除空白组外，其他组大鼠在0.3%戊巴比妥钠麻醉状态下消毒后，在大鼠右侧踝关节腔内注射0.1 mL尿酸钠溶液（50 mg/mL）；空白组大鼠在相同的条件下注射0.1 mL生理盐水。造模大鼠踝关节肿胀程度、疼痛水平明显高于空白组，并出现关节炎的各种症状，则提示模型成功[25]。

1.2.5 实验给药 造模成功后6 h进行灌胃给药，按照《中药药理研究方法学》大鼠用药为成人（60 kg体质量）6.3倍进行换算，竹叶石膏汤组大鼠灌胃给予竹叶石膏汤（0.5 g/kg）；秋水仙碱组大鼠灌胃给予秋水仙碱片悬浊液（0.3 mg/kg)；空白组及模型组大鼠灌胃给予等体积蒸馏水，1次/d，连续给药14 d。

1.2.6 观察指标

1.2.6.1 踝关节直径测量 使用游标卡尺测量并记录大鼠治疗前后右侧踝关节直径。

1.2.6.2 血清尿酸检测 给药结束后，0.3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹正中切开，逐层钝性分离至腹主动脉清晰可见，采用一次性采血针采血，静置2 h，3 000 r/min离心10 min，收集血清，采用血生化仪检测大鼠血清中尿酸含量。

1.2.6.3 踝关节滑膜组织中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相对表达量 取大鼠右踝关节滑膜组织，按TRIzol试剂盒操作方法提前总RNA，随后利用反转录试剂盒扩充，严格按试剂盒操作步骤执行，上机进行RT-qPCR反应，条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40个循环。以GAPDH作为内参，2-△△Ct法计算目的基因相对表达情况，引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.2.7 统计学方法 通过SPSS 20.0进行统计学分析，计量资料通过Shapiro-Wilk进行正态性检验，符合正态分布的计量资料采用（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，方差齐采用Bonferroi进行两两比较。组内治疗前后比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 竹叶石膏汤的主要成分及潜在靶点获取 筛选出竹叶石膏汤的主要化学成分147种。（见表2）去除重复并通过Uniprot数据库标准基因名转换后，共得到584个作用人类的基因靶点。通过GeneCards、OMIM数据库共检索到与痛风性关节炎相关基因223个，相匹配映射得到竹叶石膏汤治疗痛风性关节炎靶点共40个。（见图1）

图1 竹叶石膏汤靶点与痛风性关节炎靶点匹配韦恩图

表2 竹叶石膏汤中部分活性化合物基本信息

2.2 构建药物-化合物-靶点网络 利用Cytoscape 3.7.1，构建竹叶石膏汤中药物-活性化合物-靶点网络。网络包含737节点，其中药物节点7个、活性化合物节点147个和靶点节点584个，2 485条边。图中不同颜色及形状代表不同含义：浅蓝色四边形代表竹叶石膏汤，彩色六边形代表活性化合物，紫色菱形代表靶点基因。网络中的每条边代表药物所含有的活性化合物及活性化合物与靶点基因之间的相互作用关系。（见图2）

图2 “竹叶石膏汤-活性成分-靶点”网络图

2.3 “竹叶石膏汤-活性成分-基因靶点-疾病”网络构建 通过Cytoscape软件，把上述获得的竹叶石膏汤活性成分、靶点基因、疾病导进软件中，进一步构建“竹叶石膏汤-活性成分-靶点基因-疾病”可视化网络。（见图3）

图3 “竹叶石膏汤-活性成分-靶点基因-疾病”网络图

2.4 PPI及Hub蛋白确定 利用String在线数据库，把痛风性关节炎相关靶点基因导入其中，将未连接的靶点隐藏，进一步获得PPI网络（见图4）。通过“Network Analyzer”工具，进一步计算得出各作用靶标的连接度。连接度最高的5个靶标分别为白细胞介素受体相关激酶4（IRAK4）、白细胞介素-6（IL-6）、CXC基序趋化因子配体8（CXCL8）、CC基序趋化因子配体2（CCL2）、白细胞介素-10（IL-10）。（见图5）由此可知，上述5个靶标在竹叶石膏汤治疗痛风性关节炎中发挥了重要作用，为潜在核心靶标。进一步证实了竹叶石膏汤治疗痛风性关节炎是通过作用于多个靶标而发挥多种效果。

图4 蛋白相互作用PPI 网络

图5 中药-疾病核心靶标的条图

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析结果显示，竹叶石膏汤治疗痛风性关节炎的核心基因的BP功能主要包括炎症反应的调节、细胞对脂多糖的反应、细胞对细菌来源分子的反应等，CC的靶点主要富集在细胞质囊泡腔、囊泡腔、质膜筏等，MF功能主要涉及细胞因子活性、细胞因子受体结合、受体配体活性等。（见图6）

图6 GO 功能富集分析柱状图

2.6 KEGG通路富集分析 竹叶石膏汤治疗痛风性关节炎核心基因的KEGG通路主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路、类风湿关节炎信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路等。（见图7）

图7 KEGG 通路富集分析气泡图（前20 的通路）

2.7 各组大鼠踝关节直径比较 治疗前，模型组、秋水仙碱组及竹叶石膏汤组大鼠踝关节直径明显大于空白组（P＜0.05），表明痛风性关节炎模型造模成功。治疗后，模型组大鼠踝关节直径与治疗前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；秋水仙碱组及竹叶石膏汤组大鼠踝关节直径明显小于治疗前（P＜0.05）；治疗后，秋水仙碱组和竹叶石膏汤组大鼠踝关节直径明显小于模型组（P＜0.05）。表明秋水仙碱及竹叶石膏汤均可缓解GA大鼠关节肿胀程度。（见表3）

表3 各组大鼠踝关节直径比较 （±s，cm）

表3 各组大鼠踝关节直径比较 （±s，cm）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

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2.8 各组大鼠血清尿酸含量比较 与空白组比较，模型组大鼠血清尿酸含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，秋水仙碱组和竹叶石膏汤组大鼠血清尿酸含量均明显降低（P＜0.05），且竹叶石膏汤组大鼠血清尿酸含量低于秋水仙碱组（P＜0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠血清尿酸比较 （±s，μmol/L）

表4 各组大鼠血清尿酸比较 （±s，μmol/L）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与秋水仙碱组比较，cP＜0.05。

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2.9 各组大鼠踝关节滑膜组织中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相对表达量比较 与空白组比较，模型组大鼠踝关节滑膜组织中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，秋水仙碱组和竹叶石膏汤组大鼠踝关节滑膜组织中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA相对表达量均明显降低（P＜0.05），且竹叶石膏汤组大鼠踝关节滑膜组织中IRAK4 mRNA相对表达量低于秋水仙碱组（P＜0.05），而竹叶石膏汤组大鼠踝关节滑膜组织中IL-6 mRNA相对表达量与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表5）

表5 各组大鼠踝关节滑膜组织中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA 相对表达量比较 （±s）

表5 各组大鼠踝关节滑膜组织中IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA 相对表达量比较 （±s）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与秋水仙碱组比较，cP＜0.05。

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3 讨论

随着生活水平的提高，且大众的运动时间逐渐减少，GA的发病率逐年升高。然而，GA治疗尚未达成共识，本研究基于生物信息学分析挖掘探索竹叶石膏汤治疗GA的潜在有效活性成分、分子靶点及作用机制，发现竹叶石膏汤治疗GA的潜在作用机制是“多成分-多靶点-多途径”的。同时本研究进一步通过动物实验验证竹叶石膏汤可以有效缓解GA大鼠踝关节肿胀，降低血清尿酸含量，并能抑制IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表达，为竹叶石膏汤治疗GA提供了理论依据。

本研究通过构建竹叶石膏汤-活性成分-靶点网络，并进行网络拓扑学分析发现，竹叶石膏汤治疗GA的潜在活性成分主要包括豆甾醇、山奈酚和维生素C等。FERRAZ-FILHA Z S等[26]研究发现，豆甾醇能够通过抑制肝脏黄嘌呤氧化酶的活性来降低高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平，并能明显降低尿酸单钠盐结晶引起的足部水肿，具有明显的抗氧化活性。MISRA A等[27]发现山奈酚与秋水仙碱均具有抗痛风活性，能抑制MSU激活NLRP3炎症小体，从而抑制IL-1β释放。此外，维生素C作为抗氧化剂可抑制TXNIP蛋白激活，从而减轻MSU引起的GA[28-29]。因此，竹叶石膏汤中的有效活性成分可能通过降低血清尿酸水平，并抑制NF-κB途径减少炎症细胞因子的产生，从而发挥减缓GA进展的协同作用。

本研究通过将竹叶石膏汤靶点与GA的差异表达基因进行相互映射得出40个潜在分子靶点，进一步利用Cytoscape软件中的Cytohubba、BisoGenet及CytoNCA插件得出竹叶石膏汤治疗GA的潜在治疗靶点。潜在靶点分别是IL-6、CXCL8、CCL2、IRAK4、IL-10。研究[30-31]发现，IL-6在GA患者关节滑膜及血清中表达升高，并能参与多种疾病的炎症反应，可促进IL-1β及TNF-α等炎症因子释放，从而加速GA病变过程。SO A K等[32]研究发现，CXCL8是一种巨噬细胞分泌的趋化因子，主要作用于中性粒细胞募集与活化，从而激活炎症反应的发生。GRAINGER R等[33]研究发现，高尿酸血症患者血清CCL2水平升高，从而导致循环中CD14+单核细胞增加，而CD14+单核细胞是GA发作期间最早迁移到炎症部位的白细胞之一。研究发现，IL-10可作为抗炎因子抑制MSU诱导的巨噬细胞源性TNF-α和炎症蛋白（MIP-1α和MIP-1β）的表达[34]。痛风发作时，Toll样受体4会被尿酸盐结晶激活，进一步逐渐活化下游的各级激酶，如IRAK4等进行自身的磷酸化，最终活化核转录因子-κB，释放IL-6等炎症细胞因子，诱导炎症反应的发生[34]。本研究通过实验动物验证了竹叶石膏汤可以有效抑制GA大鼠滑膜组织IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表达，减缓GA大鼠踝关节肿胀，降低GA大鼠血清尿酸。

本研究靶基因KEGG富集分析结果提示，炎症反应的调节、细胞对脂多糖、细菌侵袭及生物刺激的反应、IL-17信号通路和TNF信号通路等可能是竹叶石膏汤治疗GA的潜在作用途径。研究[36-37]表明，GA是由先天免疫系统激活驱动的典型炎症性疾病，是MSU诱导的炎症反应引起的，主要由巨噬细胞和中性粒细胞介导，特别是NLRP3炎症小体的激活，从而导致IL-1β和其他炎症细胞因子的释放。因此，调节炎症反应是治疗GA的关键。另外，RAUCCI F等[38]研究发现IL-17可能在MSU诱发的急性GA晚期阶段起关键作用。此外，MSU可介导炎症因子的释放，激活NF-κB启动和调节TNF-α与炎性免疫反应有关的炎症介质、黏附分子等相关基因的表达，从而加速GA的炎症反应。同时，竹叶石膏汤中的有效活性成分具有降低血清尿酸水平、减少MSU堆积的作用，并能抑制NF-κB途径减少炎症细胞因子的产生，因此，推测竹叶石膏汤能发挥抑制尿酸盐结晶形成、抗炎等作用机理起到治疗或延缓GA病变过程。秋水仙碱能通过降低白细胞活动、吞噬作用及减少乳酸形成，从而减少尿酸结晶的沉积，减轻炎症反应，发挥止痛作用[39-40]。因此，本研究选择秋水仙碱作为阳性对照药物。本研究仍然存在局限性：（1）本研究GA动物模型仅挑选核心靶点IRAK4及IL-6进行验证，其他核心靶点及通路有待进一步研究；（2）竹叶石膏汤有效成分复杂，具体何种成分起到治疗GA的关键，有待进一步实验探讨。

综上所述，竹叶石膏汤可通过“多成分-多靶点-多途径”有效抑制GA大鼠滑膜组织IRAK4 mRNA、IL-6 mRNA的表达，减缓踝关节肿胀，降低血清尿酸，从而发挥对GA的治疗作用。