基于16S rDNA测序探究电针干预对自发性高血压大鼠肠道菌群的影响*

徐梦月，白 娟，王 强

（1.陕西中医药大学第二临床医学院，陕西 咸阳 712000；2.西安交通大学第一附属医院，陕西 西安 710061）

高血压是全球最常见的慢性心血管疾病，严重危害人类健康。充分的证据表明，针灸降压疗效确切、真实、可靠，且能在降压的同时减少药物所带来的毒副反应，是一种值得在临床上推广应用的治疗方法[1-4]。但针灸降压的具体机制至今尚未明确，一定程度上限制了该项疗法的推广应用，因此明确针灸降压的机制显得尤为重要。中医学认为，针灸以人体经络理论为基础，通过对人体脏腑气血阴阳之失衡进行良性调节，从而促使人体恢复阴平阳秘的正常生理状态。针灸治疗效应是机体多靶点共同作用的结果。研究发现，针灸可以通过调节肠道菌群的结构和组成，增加有益菌丰度而降低致病菌丰度，从而改善肥胖、糖尿病及结肠炎等疾病[5-7]。肠道菌群是定植在人类胃肠道内数以万计的微生物的总称，其组成变化在诱导和促进高血压的发生发展中发挥重要作用[8]。研究显示，肠道菌群可通过调节迷走神经、分泌神经递质、免疫调节、产生微生物代谢物及影响肠神经系统参与血压的调控[9-10]。因此，本研究拟采用16S rDNA测序分析自发性高血压大鼠（spontaneously hypertension rats，SHR）与Wistar京都种（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠大肠内容物菌群变化，探索电针干预对SHR肠道菌群的影响，进一步丰富电针降压的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄SPF级雄性SHR大鼠20只，同周龄SPF级雄性WKY大鼠10只，两种大鼠体质量均为240~260 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证编号：SCXK（京）2021-0006。大鼠饲养在西安交通大学基础医学院动物房，饲养环境：室温（22±2）℃，湿度55%~65%，12 h光照/12 h黑暗交替，所有大鼠均可自由摄食和饮水。实验结束后，动物均在麻醉状态下（10%水合氯醛腹腔注射）进行处死，以尽可能减少痛苦。所有动物实验方案和程序均经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准（批准号：2020-286）。

1.3 主要仪器 BP-100A型全自动大小鼠无创血压测量系统（成都泰盟科技有限公司）；SDZ-Ⅱ型华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；环球无菌针灸针（苏州针灸用品有限公司，规格：0.25 mm×13 mm）；Bio-rad T100型梯度PCR仪（美国BIO-RAD公司）；Qubit@ 2.0Fluorometer（美国Thermo Scientific公司）。

1.4 分组与干预 将20只雄性SHR随机分成模型组和电针组，每组10只；10只雄性WKY大鼠作为对照组。3组大鼠适应性喂养1周后开始电针干预。电针组大鼠周一至周五09：00：00—12：00：00用自制鼠袋捆绑固定上半身后，取仰卧位，选取双侧足三里（位于后膝关节外下方，腓骨小头下5~7 mm）进行干预，穴位定位和具体针刺方法参照《实验针灸学》，连接电针治疗仪的输出端，给予电针刺激（疏密波，3 Hz/15 Hz，强度为1 mA，每次30 min，1次/d，连续5 d，休息2 d），共持续6周。对照组、模型组大鼠采用和电针组相同的固定方法，但不进行干预。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠血压测量 于电针的前1天（T1）及电针第2、4、6周的周六（T2、T3、T4）09:00:00—12:00:00，在大鼠清醒状态下应用无创血压测量仪测量尾动脉收缩压，所有大鼠连续测3次，取平均值。

1.5.2 大鼠肠道菌群变化检测 于电针结束前1天，收集大鼠粪便至无菌EP管中，置于-80 ℃冰箱保存备用。每组随机抽取7只大鼠的粪菌送至武汉迈特维尔生物科技有限公司，由该公司对其进行基因组DNA的提取和PCR扩增、PCR产物的混样和纯化、文库构建和上机测序及生物信息分析检测。

1.6 统计学方法

1.6.1 生物信息分析 使用Illumina NovaSeq测序得到下机数据（Raw PE），再进行拼接、质控及嵌合体过滤，得到后续可用于分析的有效数据（Effective Tags）。以97%的一致性（Identity），对每个样本的Effective Tags进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，之后对OTUs序列进行物种注释。选择QIIME 1.9.1软件和R软件分析和处理测序结果，通过Alpha多样性指数（Chao1、Shannon和Simpson）分析与基于加权Unifrac距离（weighted Unifrac）的主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA），确定各组大鼠肠道菌群的特征。

1.6.2 实验数据分析 采用SPSS 26.0进行统计分析，计量资料服从正态分布以（x±s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，方差齐时两两比较用LSD法，方差不齐时用Tamhane's T2法；血压数据比较采用重复测量资料方差分析，符合球形检验时用主体内效应检验（假设球形度），不符合球形检验时用多变量检验（比莱轨迹）。不符合正态分布的数据采用Kruskal-Wallis H检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠收缩压比较 所有大鼠不同时间点收缩压比较，差异有统计学意义（F=56.115，P=0.000），即存在时间效应。对照组大鼠收缩压随时间推进变化不明显（F=0.811，P=0.499），模型组大鼠收缩压随时间推进呈现明显升高趋势（F=545.691，P=0.000），电针组大鼠收缩压随时间推进呈现明显下降趋势（F=43.200，P=0.000）。3组大鼠收缩压总体比较，差异有统计学意义（F=2 358.157，P=0.000），即存在分组效应。干预前1天电针组大鼠收缩压与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05），其余各时间点电针组大鼠收缩压均明显低于模型组（P<0.05），且电针组和模型组大鼠在各时间点的收缩压均明显高于对照组（P<0.05）。时间因素与分组因素之间存在交互效应（F=27.468，P=0.000），即各组大鼠干预前后收缩压变化幅度不一致。上述结果提示电针干预可以降低大鼠血压。（见表1、图1）

图1 各组大鼠收缩压交互效应轮廓图

表1 各组大鼠不同时间点收缩压比较 （±s，mm Hg）

表1 各组大鼠不同时间点收缩压比较 （±s，mm Hg）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与电针组比较，cP<0.05；与干预前1天比较，dP<0.05。

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2.2 物种注释及测序质量分析 由3组样本聚类得到的OTUs韦恩图（见图2）可知，3组共有1 733个相同OTUs，对照组有225个特征OTUs，模型组有511个特征OTUs，电针组出现378个特征OTUs并有491个OTUs发生了改变。3组样本的稀释曲线均趋向平坦，说明实验测序深度足够，当序列接近50 000时再增加序列只会产生少量新的物种。（见图3）当箱形图位置随着样本量的增加而趋于平缓时，表示此实验中的物种不会再随样本量的增加而明显增多，提示样本量充分。（见图4）

图2 OTUs 韦恩图

图3 稀释曲线图

图4 物种累积箱图

2.3 肠道菌群多样性分析 本实验采用Alpha多样性中的ACE、Shannon和Simpson指数来分析菌群的丰富度和多样性。其中，ACE指数用于估计群落中OTU数目，该指数越大，菌群丰富度越高。Shannon和Simpson指数用于衡量群落的多样性和均匀度，群落多样性越高，物种分布越均匀，Shannon指数越大，Simpson指数也越大。由表2知，模型组大鼠菌群ACE指数高于对照组和电针组，但差异无统计学意义（P>0.05）。对照组和电针组大鼠菌群Shannon指数与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。对照组和电针组大鼠菌群Simpson指数高于模型组（P<0.05）。采用基于weighted Unifrac距离的PCoA法，进一步比较3组样本肠道菌群物种构成差异程度，结果发现对照组与模型组距离较远，提示与对照组比较，模型组大鼠菌群组成结构发生了显著改变（Amova，P=0.002）；电针组与模型组距离较远，但与对照组距离较近，提示与模型组比较，电针干预后的菌群物种构成发生了明显变化（Amova，P=0.003）。（见图5、表3）

图5 基于weighted unifrac 距离PCoA 分析

表2 3 组大鼠菌群Alpha 多样性指数比较 （±s）

表2 3 组大鼠菌群Alpha 多样性指数比较 （±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

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表3 Amova 组间差异分析

2.4 肠道菌群结构组成分析 统计3组大鼠在门水平和属水平丰度排名前10的物种并绘制成丰度柱状图。（见图6~7）在门水平上，3组大鼠优势菌门均为厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。其中，与对照组比较，模型组大鼠厚壁菌门相对丰度升高，拟杆菌门相对丰度降低，F/B值明显升高（P<0.05）；与模型组比较，电针组大鼠厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度升高，F/B值显著降低（P<0.05）。（见表4）在属水平上，与对照组比较，模型组大鼠Lactobacillus、Treponema、Clostridium_sensu_stricto_1、Blautia、Turicibacter相对丰度明显升高（P<0.05），Ruminococcus、Prevotellaceae_Ga6A1_group、Anaerostipes相对丰度明显降低（P<0.05）；与模型组比较，电针组大鼠以上菌属均得到改善，Lactobacillus、Treponema、Clostridium_sensu_stricto_1、Blautia、Turicibacter相对丰度均明显降低（P<0.05），Ruminococcus和Anaerostipes相对丰度均明显升高（P<0.05）。（见表5）

图6 3 组大鼠前10 门水平菌群丰度构成图

图7 3 组大鼠前10 属水平菌群丰度构成图

表4 3 组大鼠F/B 值比较 （±s）

表4 3 组大鼠F/B 值比较 （±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

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表5 3 组大鼠前10 属水平组间差异物种比较 （±s）

表5 3 组大鼠前10 属水平组间差异物种比较 （±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

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3 讨论

中医学多将高血压归属于“头痛”“眩晕”等范畴，主要由脾虚痰湿、肝气不舒、气血瘀滞引起。足三里穴属足阳明胃经穴，具有健脾和胃、补中益气、通腑化痰之功效。足阳明胃经为多气多血之经，因此针刺足三里能够刺激整条经脉，可通经活络，调和气血，调理经脉，最终达到平衡血压的目的。另外，足阳明胃经于头面部分布密集，且经脉循行不仅属胃，散脾，还上通于心，而心又主血脉，故针刺足三里穴能调节机体血液运行，继而改善由血压升高引起的头痛、眩晕等高血压症状[11]。本研究结果表明，电针双侧足三里能够有效降低SHR的血压，这和王珊珊[12]的研究结果类似。以往研究显示，针刺降压是多靶点的效应，但具体机制不明。近年来，肠道菌群在调节血压方面发挥重要作用，并鉴于足三里穴具有调节肠道的作用，因此我们研究了电针双侧足三里对肠道菌群的影响，以此探索与电针降压可能相关的菌群机制。

肠道菌群被认为是维持血压稳态的关键因素[13-14]。且越来越多的证据表明，肠道微生物在高血压患者和高血压动物模型中发挥了重要作用[15-17]。有研究[15-16]显示，与健康对照组比较，高血压患者及高血压动物模型的肠道微生物丰度和多样性均明显降低。F/B值为评估肠道生理稳态的生物标志物。在自发性高血压大鼠和血管紧张素Ⅱ诱导的高血压模型中，F/B值呈现显著的升高趋势，而F/B值增加被广泛认为是肠道稳态失调的特征[16,18]。此外，粪菌移植实验发现，将WKY的粪便移植给SHR后，SHR的肠道菌群显著改善，血压下降；而将SHR的粪便移植给WKY后，WKY的收缩压和F/B值明显增加。这进一步证实了肠道菌群失调是造成高血压的重要原因[19]。本研究显示，与对照组比较，模型组大鼠菌群多样性降低，F/B值显著升高，而通过电针干预后菌群多样性有所增加，F/B值明显降低，并与对照组水平趋于一致，结合PCoA分析中3组大鼠的物种构成差异，表明电针在一定程度上能够调节肠道菌群的结构和组成，改善高血压大鼠的肠道菌群紊乱。

进一步分析显示，模型组大鼠肠道微生物中乳酸产生菌（Lactobacillus、Turicibacter）丰度增加，这与以往报道结果一致[16,20]。在高血压动物模型中，乳酸产生菌显著增加，且血浆乳酸水平与血压升高有关[21-22]，经电针干预后，乳酸产生菌明显降低。此外，本研究显示模型组大鼠Ruminococcus、Anaerostipes及Prevotellaceae_Ga6A1_group的丰度显著降低，经电针干预后丰度增加。研究表明，Ruminococcus可通过产生羟基类固醇脱氢酶，促进次级胆汁酸石胆酸（Lithocholic acid，LCA）和脱氧胆酸（Deoxycholic acid，DCA）的生成[23]，而血浆LCA和DCA水平的增加有助于降低血压[24-25]。Ruminococcus还能够产生具有抗炎作用的丁酸盐，为肠道上皮细胞提供能量，并通过各种机制维持肠道健康[26-27]。Anaerostipes亦可产生丁酸盐，并能通过保护肠道屏障功能及发挥免疫调节和抗炎作用来维持肠道内环境稳态，从而改善高血压[28]。Prevotellaceae_Ga6A1_group能够产生乙酸盐。后者可抑制心肌肥大，改善心功能，减少心脏和肾脏纤维化，继而缓解高血压[29-30]。

综上所述，本研究通过对SHR双侧足三里进行电针干预，发现电针可能是通过改变肠道菌群的结构及组成，重塑肠道的动态平衡，增加Ruminococcus、Anaerostipes、Prevotellaceae_Ga6A1_group等降压相关的短链脂肪酸产生菌的丰度，降低Lactobacillus、Turicibacter等乳酸产生菌的丰度，发挥降压作用。后期还需对筛选出的可能与降压相关的Ruminococcus、Anaerostipes、Prevotellaceae_Ga6A1_group靶菌进行研究，并开展相关粪菌移植实验，进一步验证电针改善后的肠道菌群和高血压之间的因果关系，为电针降低血压的肠道菌群机制提供依据。