蛇床子素介导TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路调控结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭*

崔庆丰，李嫦娥，王 芳

（1.河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056001；2.秦皇岛军工医院，河北 秦皇岛 066000）

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，目前临床上仍缺乏有效的治疗手段。蛇床子素是一种提取自蛇床子的呋喃类香豆素化合物，能在多种恶性肿瘤中发挥抑癌作用[1-3]。蛇床子素可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[4]，增强肾癌小鼠免疫系统功能，抑制肿瘤细胞增殖和迁移[5]。但是蛇床子素在结肠癌中的作用需要进一步研究。研究表明，Toll样受体4（toll like receptor 4，TLR4）/髓样细胞分化因子88（myeloid differentiation factor，MyD88）/核因子κB（nuclear factor，NF-κB）信号通路在结肠癌中被激活，穿心莲内酯能通过抑制该信号通路发挥抗结肠癌作用[6]。本实验拟探讨蛇床子素是否能通过调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥抗结肠癌作用。

1 材料

1.1 细胞系 人结肠癌SW480细胞系（批号：FS-0374）购自美国ATCC公司。

1.2 试剂 蛇床子素（纯度≥98%，大连美仑生物技术有限公司，批号：MB6894）；DMEM培养基（批号：12634010）、胰蛋白酶（批号：25200-056）、胎牛血清（批号：6140079）均购自美国Gibco公司；MTT试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，批号：C0009）；BCA试剂盒（批号：PC0020-500）、ECL发光液（批号：PE0010）均购自北京索莱宝生物科技有限公司；兔抗人TLR4 抗体（批号：ab22048）、兔抗人MyD88 抗体（批号：ab133739）、兔抗人NF-κB抗体（批号：ab141406）、兔抗人GAPDH抗体（批号：ab8245）均购自美国Abcam公司；山羊抗兔二抗（美国Biovision公司，批号：6903-250）。

1.3 主要仪器 SpectraMax iD5-多功能酶标仪（美国MD公司）；DYY-6C电泳仪（北京六一仪器厂）；CKX-41型倒置显微镜（日本奥林巴斯）；CLM-050B-8型二氧化碳恒温培养箱（青岛佳鼎分析仪器有限公司）；MINI Space1000全自动凝胶图像分析系统（上海天能生命科学有限公司）。

2 方法

2.1 MTT法检测细胞增殖情况 常规培养SW480细胞至第3代，制备单细胞悬液，取200 μL接种于6孔板，细胞贴壁生长后，分别用含不同浓度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素的培养基培养，同时设置空白孔（只加入培养基），培养24 h后，加入MTT（5 mg/mL）溶液20 μL，重新培养4 h后，加入二甲基亚砜150 μL，震荡混匀，测定450 nm波长处吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=[（A实验孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）]×100%。

2.2 平板克隆实验检测细胞增殖情况 采用不同浓度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素处理SW480细胞后，将细胞制成单细胞悬液，接种于6孔板，培养14 d，弃掉培养基，PBS清洗培养板2次，4%多聚甲醛固定细胞15 min，0.1%结晶紫染色15 min，风干后，计算各组细胞菌落数。

2.3 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 采用不同浓度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素处理SW480细胞后，制成单细胞悬液，密度为3×105/mL，取200 μL单细胞悬液接种于铺满基质胶的上室中，下室中加入600 μL完全培养基，将小室置于培养箱中24 h后，取出小室，湿棉签擦去多余未迁移细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下随机选取3个视野观察并计数。

SW480细胞迁移能力测定：除Transwell上室中不铺满基质胶外，其余操作同上。

2.4 蛋白印迹法检测TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达 采用不同浓度（0、50、100、200 μmol/L）蛇床子素处理SW480细胞24 h后，加入裂解液裂解30 min，12 000 r/min离心10 min（离心半径=8 cm），提取细胞中总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入5倍上样缓冲液，100 ℃煮沸变性。120 V电泳2 h，0.3 A湿转2 h，室温封闭1 h，分别加TLR4、MyD88和NF-κB抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，洗膜，加二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，洗膜，ECL发光液显影，Image J分析条带灰度值。

2.5 统计学方法 采用SPSS 26.0统计学软件分析数据，符合正态分布的计量资料均以（x±s）描述，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组细胞存活率比较 50、100、200 μmol/L蛇床子素组细胞存活率低于0 μmol/L蛇床子素组，且随蛇床子素浓度的升高，细胞存活率逐渐降低（P＜0.05）。（见表1）表明蛇床子素可抑制结肠癌SW480细胞增殖。

表1 各组细胞存活率比较 （±s）

表1 各组细胞存活率比较 （±s）

注：与0 μmol/L蛇床子素组比较，aP＜0.05；与50 μmol/L蛇床子素组比较，bP＜0.05；与100 μmol/L蛇床子素组比较，cP＜0.05。

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3.2 各组细胞菌落数比较 50、100、200 μmol/L蛇床子素组细胞菌落数少于0 μmol/L蛇床子素组，且随蛇床子素浓度的升高，细胞菌落数逐渐减少（P＜0.05）。（见表2、图1）表明蛇床子素可抑制结肠癌SW480细胞增殖。

图1 平板克隆实验检测细胞增殖情况

表2 各组细胞菌落数比较 （±s）

表2 各组细胞菌落数比较 （±s）

注：与0 μmol/L蛇床子素组比较，aP＜0.05；与50 μmol/L蛇床子素组比较，bP＜0.05；与100 μmol/L蛇床子素组比较，cP＜0.05。

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3.3 各组迁移细胞数比较 50、100、200 μmol/L蛇床子素组迁移细胞数少于0 μmol/L蛇床子素组，且随蛇床子素浓度的升高，迁移细胞数逐渐减少（P＜0.05）。（见表3、图2）表明蛇床子素可抑制结肠癌SW480细胞迁移。

图2 结晶紫染色检测迁移细胞数 （×200）

表3 各组迁移细胞数比较 （±s）

表3 各组迁移细胞数比较 （±s）

注：与0 μmol/L蛇床子素组比较，aP＜0.05；与50 μmol/L蛇床子素组比较，bP＜0.05；与100 μmol/L蛇床子素组比较，cP＜0.05。

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3.4 各组侵袭细胞数比较 50、100、200 μmol/L蛇床子素组侵袭细胞数少于0 μmol/L蛇床子素组，且随蛇床子素浓度的升高，侵袭细胞数逐渐减少（P＜0.05）。（见表4、图3）表明蛇床子素可抑制结肠癌SW480细胞侵袭。

图3 结晶紫染色检测侵袭细胞数 （×200）

表4 各组侵袭细胞数比较 （±s）

表4 各组侵袭细胞数比较 （±s）

注：与0 μmol/L蛇床子素组比较，aP＜0.05；与50 μmol/L蛇床子素组比较，bP＜0.05；与100 μmol/L蛇床子素组比较，cP＜0.05。

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3.5 各组TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相对表达量比较 50、100、200 μmol/L蛇床子素组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量均低于0 μmol/L蛇床子素组，且随蛇床子素浓度的升高，TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相对表达量逐渐降低（P＜0.05）。（见表5、图4）表明蛇床子素可抑制结肠癌SW480细胞TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达。

图4 各组细胞中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表达Western blotting 图

表5 各组TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白相对表达量比较（±s）

表5 各组TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白相对表达量比较（±s）

注：与0 μmol/L蛇床子素组比较，aP＜0.05；与50 μmol/L蛇床子素组比较，bP＜0.05；与100 μmol/L蛇床子素组比较，cP＜0.05。

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4 讨论

结肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，临床上常采用手术、化疗及靶向治疗等方法治疗本病，但术后易复发，化疗存在较大毒副作用，且仍存在预后效果差、患者生存率低等问题。故探讨结肠癌发生的具体机制、寻找有效的治疗药物具有重要意义[7]。

蛇床子素化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，又称为甲氧基欧芹酚。蛇床子素具有抗炎、抗氧化及镇痛等多种药理学活性[8-10]。研究发现，蛇床子素具有广泛的抗肿瘤活性。杨娟等[11]研究表明蛇床子素可抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、诱导癌细胞凋亡，且体内研究表明蛇床子素可抑制裸鼠视网膜母细胞瘤生长。蛇床子素可使前列腺癌LNCaP细胞周期阻滞在G2/M期，诱导癌细胞凋亡和衰老[12]。此外，蛇床子素可抑制舌鳞癌Tca8113细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞自噬，损伤细胞自噬途径[13]。蛇床子素能通过促进促凋亡蛋白表达，抑制抗凋亡蛋白表达，阻碍卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导其凋亡[14]。由此可见，蛇床子素可通过多种途径对恶性肿瘤发挥抑制作用，但是蛇床子素在结肠癌中的作用鲜有报道。

本研究结果显示：SW480细胞经不同浓度蛇床子素处理后细胞存活率降低，平板克隆实验表明细胞菌落数随蛇床子素浓度升高而减少，Transwell实验显示迁移和侵袭细胞数随蛇床子素浓度升高而减少。以上结果表明蛇床子素可抑制结肠癌SW480细胞增殖、迁移和侵袭。

在哺乳动物细胞中，普遍存在着TLRs家族。该家族属于模式识别受体，行使着识别病原体相关模式分子的功能[15]。TLR4凭借特异性识别功能，使其能够结合脂多糖（LPS）；TLR4活化对促进固有免疫系统的抗原提呈细胞功能性成熟，并触发促炎介质释放具有重要作用[16-18]；TLR4在细胞膜上识别并结合LPS后，LPS-TLR4复合物能在细胞膜启动MyD88依赖的信号转导途径，将炎症信号级联传递到细胞内，使级联反应持续发生。转录因子NF-κB发生核移位进入细胞核后，可调控早期炎症介质的合成分泌[19-21]。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在恶性肿瘤中异常表达。LI C等[22]研究发现，淫羊藿苷能通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活，降低宫颈癌炎症反应，诱导癌细胞凋亡，调节肿瘤细胞免疫反应。姜黄素能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路降低肾细胞癌炎症反应，促进促凋亡蛋白表达，抑制抗凋亡蛋白表达，从而发挥抗肾细胞癌作用[23]。金刚烷连接的异硫脲衍生物能通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB信号通路抑制实验性肝癌生长[24]。参苓白术散可降低Lewis肺癌小鼠TLR4、MyD88蛋白表达水平，增加Caspase-3蛋白表达水平，并能通过调控TLR4/MyD88通路，促进肿瘤细胞凋亡[25]。由此可见，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在恶性肿瘤的进展中发挥了重要作用。因此，本研究通过蛋白印迹法检测蛇床子素对该信号通路的调节作用，结果表明：TLR4、MyD88和NF-κB蛋白相对表达量随蛇床子素浓度的升高逐渐降低，说明蛇床子素可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活。

综上所述，蛇床子素可抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，其可能是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路发挥作用。