球孢白僵菌SCAUJH19和甲维盐对斜纹夜蛾的协同作用及制剂研究

李佳颖 肖志鹏 张慎 蔡海林 滕凯 曾维爱 伍绍龙 周向平

摘 要： 菌药复配可弥补各自的不足，为害虫防治提供了新的思路。为明确球孢白僵菌SCAUJH19与甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（甲维盐）的相容性及其联合毒力和复配制剂，本文测定了不同浓度甲维盐和球孢白僵菌SCAUJH19混合后对菌株孢子萌发和菌落生长的影响，测定了球孢白僵菌SCAUJH19与甲维盐联合使用对斜纹夜蛾2龄幼虫的毒力，并根据最优菌药组合对复配制剂进行了研究。结果表明：球孢白僵菌SCAUJH19和甲维盐有较好的相容性；0.5～20 mg/L甲维盐处理的球孢白僵菌SCAUJH19在第3天时孢子萌发率为96.11%～98.01%；在第7天时0.5 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L甲维盐处理球孢白僵菌SCAUJH19的菌落直径分别为42.95 mm、44.50 mm、41.98 mm，与空白对照差异不显著。 球孢白僵菌SCAUJH19和甲维盐组合1×108孢子/mL+1.5 mg/L、 1×108孢子/mL+0.5 mg/L和1×107孢子/mL+1.0 mg/L第7天时对斜纹夜蛾2龄幼虫校正死亡率分别为100%、95%和95%，高于其他菌药组合和菌药单剂，3种组合致死中时（LT50）也比单用球孢白僵菌SCAUJH19短。复配剂油悬浮剂第3天时对斜纹夜蛾2、3、4、5龄幼虫的致死率最高均为100%。复配剂可湿性粉剂第3天时对斜纹夜蛾2、3、4、5龄幼虫的致死率最高分别为96.39%、94.58%、83.33%、100%。复配剂油悬浮剂和可湿性粉剂对斜纹夜蛾幼虫有明显毒杀作用，油悬浮剂对高龄斜纹夜蛾幼虫的致死力要优于可湿性粉剂。

关键词： 斜纹夜蛾；真菌；杀虫剂；毒力测定；相容性

中图分类号：S476.12

文献标识码：A

文章编号：1008－0457（2023）02－0008－09

国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.02.002

斜纹夜蛾 Spodoptera litura 是一种杂食性的世界性农业害虫，在全国各地均有分布［1］。目前斜纹夜蛾的防治主要依赖于化学农药，由于近年来化学农药的大量、频繁及不合理施用，斜纹夜蛾对防治药剂产生了不同程度的抗药性［2］。大量使用化学农药不仅造成害虫抗药性，也给生态环境造成了严重的污染，因此寻找一种高效、安全、可持续的生物防治措施势在必行。利用虫生真菌进行害虫防治是生物防治的一种重要手段，具有环境友好、种类多、分布广等优势［3］。球孢白僵菌寄主范围广泛，能够感染超过700种宿主［4］，在重要农林害虫防治中取得了较为明显的效果［5-6］。周立等［7］研究发现从田间烟草土壤中分离的球孢白僵菌SCAUYZ16和SCAUJH19孢子悬浮液浓度为1×108孢子/mL时对斜纹夜蛾2龄致死率分别为70.71%和57.84%。郭亚力等［8］发现从田间菜青虫 Hexian area 分离出的球孢白僵菌MZ050724在不同浓度的孢子悬浮液下对斜纹夜蛾2龄和3龄幼虫的最高死亡率分别为87.46%和80.56%。但是与化学药剂相比，白僵菌存在通过分生孢子等侵染体侵染害虫，作用过程缓慢［9］、野外环境复杂多样，防治效果不稳定［10］、白僵菌不同施菌方法和方式对害虫的致死效果影响较大［11］等不足。

甲维盐是在阿维菌素基础上添加其他基团合成的一种新型高效绿色杀虫剂，对鳞翅目昆虫的致死效果高于阿维菌素［12-13］。高聪芬等［14］报道无论是用浸叶法还是喷雾法测定，甲维盐对斜纹夜蛾均表现出较高的毒力。将白僵菌与杀虫剂组合使用，既弥补了白僵菌作用效果慢的缺点，又可以降低杀虫剂的使用量，发挥杀虫剂的速效作用，两者相辅相成［15］，但杀虫剂会对白僵菌孢子萌发率、生长发育、产孢量等方面产生影响，白僵菌与杀虫剂的相容性是其组合应用的前提［16］。Yadav等［17］基于白僵菌孢子形成、萌发和营养生长评估了甲维盐与白僵菌的的相互作用，发现甲维盐与白僵菌高度相容。曹伟平等［18］研究得出5%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐常规浓度5倍稀释液对白僵菌HFW-05孢子萌发没有显著的抑制作用，对菌丝生长和产孢量有一定的抑制作用，并明确了在此浓度下与白僵菌HFW-05 1×106孢子/mL孢悬液联合使用时对小菜蛾 Plutella xylostella 幼虫表现出比单用白僵菌菌株更高的杀虫效果。

可湿性粉剂具有加工简单、易使用、有效成分含量高，成本低等特点，在真菌药剂生产及推广中具有极大优势［19-20］，王海鸿等［21］通过对菌株的纯化复壮、液-固双相发酵的条件优化和发酵工艺研究配方和剂型研发等多个环节生产出了150亿孢子/g球孢白僵菌可湿性粉剂，用于西花蓟马 Frankliniella occidentalis 高效防治。将真菌做成油悬浮剂有利于孢子贮存、孢子侵染虫体和提高孢子的抗逆能力，从而达到提高防治效果的作用［22-23］，在LUBILOSA项目中将高效防蝗菌株金龟子绿僵菌IMI330189在大米或小米表面培养获得孢子粉，在使用时将孢子粉配置成油悬浮剂［24］。可湿性粉剂和油悬浮剂是菌药复配加工较为理想的剂型。

本研究以前期筛选出对斜纹夜蛾2龄幼虫高毒力菌株SCAUJH19为材料，研究球孢白僵菌SCAUJH19与甲维盐的相容性及协同增效作用，同时将球孢白僵菌SCAUJH19和甲维盐以最优组合配制成复配剂型可湿性粉剂和油悬浮剂，评价了其对不同龄期斜纹夜蛾幼虫的室內毒力，以期研制出菌药组合的最优复配制剂。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  供试虫源

斜纹夜蛾虫卵及人工饲料购于河南省济源白云实业有限公司，于RXZ-500C型智能人工气候箱（宁波江南仪器厂）中用人工饲料继代培养。饲养条件为温度27±1 ℃，光周期L14∶ D10，相对湿度（75±5）%。选取饲养三代后生长一致的斜纹夜蛾不同龄期幼虫进行试验。

1.1.2  供试药剂

76%甲维盐原药购于江西仁恒药业有限公司。

1.1.3  供试菌株

前期从湖南省永州市烟区土壤中分离，对斜纹夜蛾具高毒力球孢白僵菌SCAUJH19［25］，保存于华南农业大学生物防治教育部工程研究中心。

1.2  甲维盐对球孢白僵菌SCAUJH19孢子萌发率的影响

将供试菌株转接到Potato Dextrose Agar medium（PDA）平板后在26±1 ℃培养10 d，待产生分生孢子后用0.05％吐温-80无菌水洗脱孢子，配制成1.0×106 孢子/mL的孢子悬浮液备用。 将2 mL 1×104 孢子/mL 孢子悬浮液加入到甲维盐终浓度为0.5 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L的SDA液体培养基中，置于摇床180 rpm 25 ℃ 振荡培养。分别在24 h、48 h和72 h用移液器取样，在血球计数板上镜检各处理的孢子萌发情况，统计孢子萌发率。每处理重复3次，以加入0.05％吐温-80无菌水的液体培养基作为空白对照。

1.3  甲维盐对球孢白僵菌SCAUJH19菌丝生长的影响

将球孢白僵菌SCAUJH19菌株转接到PDA培养基上26±1 ℃培养10 d作为供试菌，用直径5 mm的打孔器打菌饼，将菌饼置于含药PDA平板进行接种，于26±1 ℃光照培养箱内培养。用十字交叉法，分别于第3天、5天和7天测定菌落直径，单位为mm。每个处理5个重复，以加入无菌水的PDA培养基作为对照。

1.4  菌株SCAUJH19和甲维盐组合对斜纹夜蛾2龄幼虫的毒力测定

按照表1对球孢白僵菌SCAUJH19和甲维盐进行不同组合复配，用毛笔将2龄幼虫挑入不同浓度菌药组合液中浸渍5 s，放入直径12 cm培养皿中，用保鲜膜封口并刺孔通气后置于智能培养箱中饲养，连续7天逐日定时观察记录。用已灭菌的0.1%的吐温-80水作对照，每个处理3次重复，每次处理20头幼虫。逐日检查斜纹夜蛾的死亡情况并记录死亡数，计算幼虫的校正死亡率：校正死亡率＝［（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）］×100%。

1.5  菌株SCAUJH19与甲维盐复配进行可湿性粉剂的制备

复配剂型制备参考Sivasundaram等［26］的方法。将25 mL的球孢白僵菌孢子悬浮液（1×107 孢子/mL）加入到发酵培养基（复配制剂总重5 mL蜜糖、2.5 g蛋白胨、2.5 g酵母、215 mL无菌水）中，在25 ℃、180 r/min條件下振荡培养72 h，接着取制剂总重的10 mL 吐温-80、5 g纤维素、5 g分散剂NNO、2 g甲维盐以及球孢白僵菌发酵液加入728 g滑石粉中，经搅拌器充分搅拌均匀，干燥72 h后，放入4 ℃恒温冰箱保存。

1.6  菌株SCAUJH19与甲维盐复配进行油悬浮剂的制备

复配剂型制备参考Kim等［27］的方法。将20 mL  1×107 孢子/mL球孢白僵菌孢子悬浮液接入 200 mL Sabouraud Dextrose Medium with Yeast Extract（SDY） 液体培养基中，25 ℃、120 r/min振荡培养72 h。1000 g大米拌入5 mL豆油和1 g硝酸钾后放入保鲜袋中湿热灭菌，与上述培养菌液充分混合后25 ℃、12 L∶ 12 D光周期条件下培养10 d。将发酵物料置于32 ℃鼓风干燥机下干燥5 d，用振动筛粉机收获孢子粉。5 g孢子粉添加到68 mL玉米油中使用磁力搅拌器搅拌30 min。乙氧基化蓖麻油和脱水山梨醇单油酸酯按7∶ 3（v/v）的比例配制10 mL乳化剂，添加到基于玉米油的孢子粉悬浮液中搅拌30 min。孢子粉悬浮液中加入2 g甲维盐原药、5 mL TDE-3和10 g海藻酸钠盐搅拌30 min后放入4 ℃恒温冰箱保存。

1.7  不同剂型对斜纹夜蛾幼虫的毒力测定

参照上述配方制得的可湿性粉剂和油悬浮剂分别稀释50倍、 100倍、250倍、500倍、1000倍后对斜纹夜蛾2至5龄幼虫进行室内毒力测定。毒力测定方法参照1.4。毒力测定数据采用Probit方法分析，求出毒力回归方程，计算LT50。并计算幼虫的死亡率（死亡率＝试虫死亡率/试虫数×100%）。

1.8  数据统计与分析

利用SPSS19.0软件进行试验数据处理分析，采用单因素方差分析对斜纹夜蛾幼虫死亡率进行结果分析，并运用Tukey检验差异显著性。用GraphPad Prism 8绘制图表。白僵菌与甲维盐协同交互作用类型的计算参照Huang等［28］的方法，具体公式如下：

Me=Ma+Mb×（1-Ma）  （1）

χ2= （Mab-Me）×100×（Mab-Me） Me   （2）

公式中，各项含义如下：

Ma：甲维盐单独对斜纹夜蛾2龄幼虫的实际校正死亡率；

Mb：高毒力菌株单独对斜纹夜蛾2龄幼虫的实际校正死亡率；

Mab：菌药复配剂对斜纹夜蛾2龄幼虫的实际校正死亡率；

将计算得出的χ2与χ2值进行比较，在χ2表格中查找df=1对应的P值为3.841。

当χ2＜3.841，则表示白僵菌和甲维盐混用表现出拮抗作用；

当χ2＞3.841，则表示白僵菌和甲维盐混用表现出协同增效作用。

2  结果与分析

2.1  甲维盐对球孢白僵菌SCAUJH19孢子萌发率及菌丝生长的影响

不同浓度的甲维盐均不影响球孢白僵菌SCAUJH19的孢子萌发率（图1）。经0.5 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L浓度的甲维盐处理3 d后，球孢白僵菌SCAUJH19 孢子萌发率分别为97.04%、96.70%、96.11%、98.01%和97.26%。

甲维盐在不同浓度下对球孢白僵菌SCAUJH19菌丝生长的影响存在差异。由图2可知，经0.5 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L甲维盐处理7 d后的球孢白僵菌SCAUJH19菌落直径分别为42.95 mm、 44.58 mm、41.98 mm、40.28 mm、33.18 mm。第7 天时球孢白僵菌SCAUJH19菌丝直径随着甲维盐浓度的增加而减小。高浓度（10和20 mg/L）的甲维盐对菌株SCAUJH19菌落生长有显著影响，但低浓度（5.0、2.5、0.5 mg/L）甲维盐处理对菌株生长无显著影响。

2.2  球孢白僵菌SCAUJH19和甲维盐两者组合对斜纹夜蛾2龄幼虫的毒力测定

由表2可知，在球孢白僵菌SCAUJH19和甲维盐联合作用对斜纹夜蛾2龄幼虫的毒力测定中，组合T6（1×108 孢子/mL+1.5 mg/L）、T8（1×108 孢子/mL+0.5 mg/L）、T10（1×107 孢子/mL+1.0 mg/L）的復配剂处理7 d后，最高校正死亡率分别为100%、90%、95%，表现出协同增效作用。这3种复配组合均有较好的增效效果，其中1×108 孢子/mL 的球孢白僵菌SCAUJH19和1.5 mg/L的甲维盐组合死亡率最高。同时各组合处理的致死中时间（LT50） 均低于各菌液单剂处理，且差异显著（表3）。

2.3  不同剂型对斜纹夜蛾幼虫的生物测定

SCAUJH19与甲维盐可湿性粉剂和油悬浮剂复配剂型对斜纹夜蛾不同龄期幼虫均有较好的致死效果。可湿性粉剂稀释1000、500、250、100、50倍对斜纹夜蛾2、3、4、5龄幼虫处理3 d后的致死率分别为71.11%～96.39%、66.67%～94.58%、53.33%～83.33%、36.67%～100%（图3）。第3天时，油悬浮剂稀释1000、500、250、100、50倍对2、3、4、5龄斜纹夜蛾幼虫的致死率分别为83.33%～100%、93.95%～100%、93.33%～100%、100%～100%（图4）。

3  结论与讨论

白僵菌具有寄主范围广、致病性强、不易产生抗性和对环境友好等优点，但也存在作用效果慢、对田间环境要求高等缺点［29-30］。研究虫生真菌与杀虫剂的相容性是开发菌药复配剂的前提，从而能更充分发挥真菌的杀虫作用［31-32］。本文对球孢白僵菌SCAUJH19与甲维盐的相容性研究表明，0.5～20 mg/L甲维盐对球孢白僵菌SCAUJH19 孢子萌发率无显著影响，且低浓度甲维盐（0.5～5 mg/L） 对球孢白僵菌SCAUJH19菌丝生长也无影响。顾丽嫱等［33］研究发现，甲维盐在第5天时对球孢白僵菌ACCC30111菌落生长的抑制率仅7.1%。Zhang等［34］对白僵菌SB063和甲维盐的相容性进行了研究，发现0.3125～2.5 mg/L甲维盐对白僵菌SB063的孢子萌发率影响较小，但0.625～5 mg/L甲维盐对白僵菌SB063的菌落生长有显著抑制作用。上述研究与本文研究中甲维盐对球孢白僵菌SCAUJH19孢子萌发率无显著影响的结果一致，但甲维盐处理对白僵菌SB063的菌落生长有显著抑制作用，却对球孢白僵菌ACCC30111和SCAUJH19无显著抑制作用。黄志等［35］研究发现，5种化学农药对绿僵菌菌株MA4和JF-813的相容性因菌株不同而不同，猜测甲维盐对白僵菌SB063、球孢白僵菌ACCC30111和SCAUJH19菌丝生长抑制作用不同可能与白僵菌菌株有关。

白僵菌往往与杀虫剂混合施用，一方面既可延缓害虫对杀虫剂的抗性，另一方面也弥补了白僵菌自身的不足［36］。本研究在测定菌株SCAUJH19和甲维盐不同组合对斜纹夜蛾2龄幼虫的毒力中，组合T6（1×108 孢子/mL+1.5 mg/L）、T8（1×108 孢子/mL+0.5 mg/L）、T10（1×107 孢子/mL+1.0 mg/L）的复配剂在处理7 d时最高校正死亡率分别达100%、90%和95%，表现出协同增效作用，且3个组合的LT50明显短于球孢白僵菌SCAUJH19单用浓度的LT50。李春香等［37］研究发现甲维盐亚致死剂量和浓度为1×107 孢子/mL的白僵菌孢子悬浮液复配后第10天对甜菜夜蛾 Spodoptera exigua 防效为90.7%，高于菌液对照的防效。王胜华等［38］研究发现，甲维盐与白僵菌或苏云金杆菌混用，均具有延长药剂持效性、延缓抗药性发展、节约一次施药用工成本等优点。这些结果都与本文研究中球孢白僵菌SCAUJH19与甲维盐表现出的协同增效作用一致。王峰等［39］研究发现药菌混用处理的LT50显著缩短，1/10推荐浓度的吡虫啉与2×106 孢子/mL的中等浓度白僵菌孢子混用杀蚜速率最快，LT50缩短了近30 h，与本文研究球孢白僵菌SCAUJH19与甲维盐联用比球孢白僵菌菌株单用的LT50缩短的结果一致，低剂量化学农药可能抑制了害虫生理和免疫活性，使原来对病原菌不敏感的寄主成为易感类群［37］，复配剂能缩短对斜纹夜蛾的致死时间，从而弥补了球孢白僵菌SCAUJH19前期致死效果不佳的缺点。

可湿性粉剂是含有原药（孢子粉）、载体、填料、表面活性剂、辅助剂并粉碎得很细的农药制剂［40］。真菌油悬浮剂是将分生孢子悬浮在油中而制成油悬液的一种制剂产品，有延长孢子的贮存期、耐雨水冲刷能力强和使用方便等优点［41-43］。本文采用不同剂型配方完成了对复配剂剂型的研发，获得了可湿性粉剂和油悬浮剂两种复配剂型，且对不同龄期的斜纹夜蛾幼虫进行了室内毒力测定。两种复配剂型对不同龄期的斜纹夜蛾幼虫均有较好的致死效果，致死率最高均可达100%。油悬浮剂对高龄斜纹夜蛾幼虫的致死力要优于可湿性粉剂。据报道，通过使用油性昆虫病原真菌制剂来控制相比于使用水性制剂具有更好的防治效果。例如，Cazorla等[44]利用13种球孢白僵菌菌株的水基制剂和油基制剂对长红锥蝽 Rhodnius Prolixus （Triatomine）的4龄幼虫进行防治，结果显示，油基分生孢子悬浮液相比于水基分生孢子悬浮液能显著提高菌株对长红锥蝽的死亡率和药效，同时降低菌株的致死中时间（LT50）。因此，针对防治对象选择合适的剂型，对于田间的推广应用具有重要的意义。

（责任编辑：胡吉凤）

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Synergistic Interaction Between the Entomopathogenic Fungus Beauveria bassiana SCAUJH19 and Emamectin Benzoate Against Spodoptera litura

Li Jiaying1，Xiao Zhipeng2，Zhang Shen1，Cai hailin3，Teng Kai4，Zeng Weiai3，Wu Shaolong5，Zhou Xiangping1*

（1.Yongzhou Tobacco Company of Hunan Province，Yongzhou，Hunan 425000，China; 2.Hengyang Tobacco Company of Hunan Province，Hengyang，Hunan 421200，China; 3.Changsha Tobacco Company of Hunan Province，Changsha，Hunan 410000，China; 4.Xiangxi Tobacco Company of Hunan Province，Xiangxi，Hunan 416000，China;5.Hunan Province Tobacco Company，Changsha，Hunan 410000，China）

Abstract：

The combination of entomogenous fungi and pesticides could make up for their shortcomings and provide new strategies for pest control.In order to determine the compatibility of  Beauveria bassiana  SCAUJH19 with emamectin benzoate and their joint toxicity and compound preparation against  Spodoptera litura ，this study determined the effects of different concentrations of emamectin benzoate mixed with  B.bassiana  SCAUJH19 on conidia germination and colony growth of the strain，the toxicity of the combination of  B.bassiana  SCAUJH19 and emamectin benzoate to  S.litura  2nd instar larvae，and conducted the compound preparation according to the optimal combination of fungi and pesticides.The results showed that  B.bassiana  SCAUJH19 had good compatibility with emamectin benzoate.The minimum conidia germination rate of  B.bassiana  SCAUJH19 treated with 0.5 mg/L-20 mg/L emamectin benzoate was 96.11%-98.01% after 3 days of inoculation.On the 7th day，the colony diameters of  B.bassiana  SCAUJH19 treated with 0.5 mg/L，2.5 mg/L and 5.0 mg/L emamectin benzoate were 42.95 mm，44.5 mm and 41.98 mm，respectively，which had no significant difference compared with the control.Different combinations of  B.bassiana  SCAUJH19 and emamectin benzoate 1×108 conidia/mL+1.5 mg/L，1×108 conidia/mL+0.5 mg/L and 1×107 conidia/mL+1.0 mg/L induced 100%，95% and 95% corrected mortality rates of instar larvae of  S.litura  after 7 days of application，which were significantly higher than mortality rates observed for individual treatments of  B.bassiana  SCAUJH19 or emamectin benzoate.The median lethal time （LT50） values observed for three combinations were also lower than those observed for individual treatments of  B.bassiana  SCAUJH19 or emamectin benzoate.The oil-based emamectin benzoate+ B.bassiana  formulation caused 100% mortality of 2nd，3rd，4th，and 5th instar larvae after 3 days of treatment.The highest mortality rates of  S.litura  2nd，3rd，4th，and 5th instar larvae induced by wettable powder were 96.39%，94.58%，83.33%，and 100% after 3 days of treatment.The compound oil-based suspension concentrates and wettable powder showed considerable efficacy against  S.litura  larvae，

and the lethality of oil suspension concentrate on S.litura  mature larvae was better than that of wettable powder.

Keywords：

Spodoptera litura ; entomopathogenic fungi; insecticides; compatibility; virulence