紫草素对糖尿病小鼠中性粒细胞胞外诱捕网表达的影响

马慧可，姚文涛，刘 欣，陈 佳，王正春，林 燕，李 萍，何秀娟

糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病的常见并发症[1-2]。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞受到刺激活化后释放到胞外的三维DNA 网状结构，其上镶嵌着瓜氨酸化组蛋白H3（citrullinated histone H3, Cit -H3）、髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO) 和弹性蛋白酶(neutrophil elastase, NE) 等杀菌蛋白，可捕获并清除病原微生物，发挥免疫防御功能[3]。然而，过多或持续存在的NETs 可导致DFU 创面愈合迟缓[4]。

紫草素是紫草的主要成分，具有杀菌、抗炎、抗肿瘤、促进伤口愈合、抗氧化和抗感染等多种生物活性，可用于治疗银屑病、系统性红斑狼疮及皮肤肿瘤等，具有广泛的应用前景[5]。最新研究发现，紫草素可提高间隙连接蛋白（connexin，Cx）家族中Cx26、Cx30 和Cx43 水平，促进慢性皮肤溃疡大鼠创面愈合，促进人角质形成细胞与成纤维细胞增殖，并因此加速慢性创面愈合、激活磷酯酰激醇3-激酶( phosphoinositide 3- kinases，PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(serine threonine protein kinase，Akt)信号通路，发挥抗炎作用，进而促进小鼠烧伤性创面愈合，但其对糖尿病性创面愈合的机制尚未明确[6-7]。本实验用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA) 刺激糖尿病小鼠骨髓来源的中性粒细胞诱导体外NETs 模型[8]，通过研究紫草素对中性粒细胞NETs生成及其标志物表达的影响，探讨其促进创面修复的机制，以期为其临床应用提供实验依据。

1 实验与材料

1.1 材料

1.1.1 动物 30 只SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠（8周，体质量18～22 g），购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物生产许可证号: SCXK（京）2019-0010。饲养于首都医科大学附属北京中医医院、北京市中医药研究所SPF 级动物室，无菌饲料单笼饲养，自由进食食物和水，室温22～24 ℃，相对湿度50%～60%，12 h 明暗交替，适应性饲养1 周。本动物实验经北京市中医药研究所动物伦理委员会批准，项目批准号：2020120203。

1.1.2 药物 紫草素（批号：517-89-5，纯度≥98%），购自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.1.3 主要试剂与仪器 小鼠骨髓来源中性粒细胞分离试剂盒（天津灏洋生物制品科技有限责任公司，货号TBD2013NM）；DMEM 培养基（葡萄糖浓度为 5.5 mmol/L，美国 HyClone 公司，货号SH30243.01）；CCK-8 试剂盒（日本同仁化学研究所，货号TR733）；Quant-iTTMPicogreenTMdsDNA Assay Kit（美国Invitrogen 公司，货号P7589）；胎牛血清（美国Gibco 公司，货号10100154）、核酸染料Sytox Green（美国Thermo 公司，货号S7020）；PMA、DNase I（美国Sigma 公司，货号分别为16561-29-8、DN25-100MG）；Cit-H3 兔重组多克隆抗体（英国Abcam 公司，货号ab281584）；活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒、DAPI 染色液、Alex Fluor®488 标记山羊抗兔抗体（上海碧云天生物技术研究所，货号分别为S0033S、ZLI-9557、S8802）；链脲佐菌素、红细胞裂解液（中国索莱宝公司，货号分别为S8050、R1010）；MCo-15AC 型二氧化碳培养箱、全自动酶标仪（美国Thermo 公司，型号分别为371、SYNERGY H1）；激光共聚焦显微镜（德国ZEISS 公司，型号LSM780）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病小鼠骨髓来源中性粒细胞的分离与培养 30 只小鼠腹腔注射0.1%链脲佐菌素(0.1 mol/L 柠檬酸盐缓冲液，pH 值4.5，40 mg/kg)，连续注射5 d；注射结束1 周后，隔天尾静脉采血并检测随机血糖，血糖值＞16.6 mmol/L 提示糖尿病小鼠模型造模成功。

在无菌条件下，体外剥离糖尿病小鼠的股骨和胫骨，冲洗内腔骨髓，70 μm 细胞筛网过滤，离心，弃上清；使用红细胞沉降液重悬细胞，于无菌硅化管中依次加入3 mL 中性粒细胞分离液及1.5 mL 80%浓度中性粒细胞分离液；吸取1 mL 细胞悬液，缓慢加于80%浓度中性粒细胞分离液上，离心。吸取中性粒细胞层，加入清洗液充分混匀，离心；弃上清，加入红细胞裂解液充分混匀，离心；弃上清，加DMEM 培养基重悬细胞，37 ℃，5%CO2培养待用。

1.2.2 药物配制 使用DMEM 培养基将紫草素粉末配成工作液（16 μg/mL，DMSO 终浓度<0.1%），过滤除菌，-80 ℃冰箱储存。DMSO 作为助溶剂时，其终浓度控制在0.1%以内，对细胞活性无影响[9]。

1.2.3 CCK-8 法检测细胞活性 将细胞以3×105个/孔的密度接种于96 孔板，加入不同浓度的紫草素培养8 h后，加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育2 h，用酶标仪在450 nm 处测定光密度（OD）值。

1.2.4 细胞分组 将细胞分为对照组、模型组、阳性对照组、紫草素高、中、低浓度组。对照组中加入DMEM 培养基；其余组中均加入PMA（100 nmol/L）；DNase I 阳性对照组中加入DNase I（0.1 mg/mL）；紫草素高、中、低浓度组中分别加入紫草素溶液（1、0.5、0.25 μg/mL）。

1.2.5 NETs 检测 将中性粒细胞以2×106/mL 接种于24 孔培养板。模型组加入100 nmol/L PMA，药物处理组同时加入1、0.5、0.25 μg/mL 紫草素，阳性对照组加入0.1 mg/mL DNase I，培养8 h，收集上清。取上清，加入Sytox Green（1 μmol/L）染色，使用荧光酶标仪检测荧光强度。

1.2.6 dsDNA 检测 将中性粒细胞以2×106/mL 接种于24 孔培养板。如上处理细胞，培养8 h，收集上清。按照PicoGreen 双链DNA 荧光定量测定试剂盒方法检测细胞上清中游离DNA 含量。稀释标准品及样品，每孔100 μL 加入到96 孔板，每孔加入100 μL 稀释的PicoGreen 工作液，混匀，室温避光2～5 min，采用荧光酶标仪检测信号强度，激发、发射光波长分别为480 nm、520 nm。利用标准品绘制标准曲线并计算各组dsDNA/NETs 含量。

1.2.7 Cit-H3 检测 将中性粒细胞以1×106/mL 接种于激光共聚焦小皿。如上处理细胞，培养6 h，加入4%多聚甲醛固定20 min。弃上清，PBS 洗涤3次。使用5% FBS 的封闭缓冲液，37 ℃孵育1 min；使用Cit-H3 兔重组多克隆抗体（1∶250），4 ℃孵育过夜。PBS 洗3 次，加入Alex Fluor®488 标记山羊抗兔抗体（1∶600），室温孵育1 h。PBS 洗3 次，加入DAPI，激光共聚焦显微镜检测Cit-H3 表达。

1.2.8 活性氧检测 将中性粒细胞以2×106/mL 接种于6 孔板，如上处理细胞培养3 h，1 000 r/min 离心5 min，弃上清；将收集的细胞重悬于1 mL 的DCFH-DA 探针(1∶1 000) 中培养20 min；洗涤后将重悬细胞接种于96 孔板，采用荧光酶标仪检测信号强度，激发、发射光波长分别为485 nm、530 nm。

1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS 20.0 进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草素对中性粒细胞活性的影响 紫草素在0.125～1 μg/mL 浓度范围内对中性粒细胞活性无影响，见表1。与对照组比较，2 μg/mL 紫草素组OD 值有降低趋势，差异无统计学意义，但依然存在一定抑制作用。1、0.5、0.25 μg/mL 紫草素组OD 值与对照组较为接近，因此，后续实验采用1、0.5、0.25 μg/mL作为紫草素高、中、低浓度组。

表1 不同浓度紫草素干预8 h 对中性粒细胞活性的影响

2.2 紫草素对中性粒细胞NETs 的影响 与对照组比较，模型组中NETs 相对荧光强度显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，DNase I组及紫草素高、中、低浓度组的中NETs 相对荧光强度显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。

表2 不同浓度紫草素对中性粒细胞NETs 水平及dsDNA 含量的影响

2.3 紫草素对中性粒细胞dsDNA 含量的影响 与对照组比较，模型组dsDNA/NETs 含量显著增高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，DNase I组及紫草素高、中、低浓度组的dsDNA/NETs 含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。

2.4 紫草素对中性粒细胞Cit-H3 表达的影响 与对照组比较，模型组中性粒细胞绿色荧光显著增强，Cit-H3 表达水平显著上调，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，DNase I 组及紫草素高、中、低浓度组的中性粒细胞绿色荧光显著减弱，Cit-H3 表达水平显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1、表3。

表3 不同浓度紫草素对中性粒细胞Cit-H3 表达及ROS 水平的影响

2.5 紫草素对中性粒细胞ROS 生成的影响 与对照组比较，模型组中性粒细胞ROS 生成显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，DNase I 组及紫草素高、中、低浓度组的ROS 水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.01），见表3。

3 讨论

糖尿病微环境激活中性粒细胞并释放大量NETs[10]。NETs 是一把双刃剑，高浓度的NETs 成分（组蛋白、杀菌肽、蛋白酶和ROS）可造成组织损伤，从而导致糖尿病创面愈合迟缓[11]。与健康人的中性粒细胞相比，糖尿病足溃疡患者的中性粒细胞更容易形成NETs，研究发现糖尿病足溃疡患者血液中NETs 及其相关生物标志物（Cit-H3、NE）的表达显著升高[12]。因此，抑制NETs 生成对于治疗糖尿病足溃疡至关重要。

PMA、细菌、损伤相关分子模式（DAMP）和细胞因子可通过TLR2、TLR4 或蛋白激酶1（RIPK1）/RIPK3/混合系激酶区域样蛋白（MLKL）途径激活PAD4，也可通过蛋白激酶C(PKC)、RAF/MEK/ERK途径诱导ROS 和MPO 生成并激活PAD4[13-15]。GMCSF、脂多糖、病原相关分子模式（PAMP）和C5a 诱导ROS 和MPO 产生并激活PAD4。以上途径均导致中性粒细胞PAD4 的激活，从而促进NETs 的形成[13]。此外，细胞外冷诱导RNA 结合蛋白（eCIRP）与髓系细胞触发受体1（TREM-1）结合并诱导细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的表达，ICAM-1 介导Rho 激活，从而促进NETs 的释放[16]。此外，无论是无菌性创面中DAMP 介导的NETs 生成，还是感染性创面中PAMP 介导的NETs 生成，各种途径产生的ROS均可激活PAD4，引起染色质解聚并释放NETs。

目前以NETS 为靶向的治疗正成为促进伤口愈合的潜在趋势。DNase I 可降解NETs 结构，促进糖尿病小鼠创面再上皮化，从而加速伤口愈合[17]。治疗性抗瓜氨酸蛋白抗体（tACPA）可特异性地与组蛋白2A（Cit-H2A）和Cit-H4 中Cit3 的瓜氨酸结合，通过抑制中性粒细胞NETs 生成或促进巨噬细胞对NETs 的摄取与清除，减轻慢性炎症和局部组织损伤[18]。抗氧化剂硫化氢通过抑制ROS 介导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中细胞外信号调节激酶（ERK）1/2 和p38 的激活来抑制NETs 生成，并改善糖尿病创面的愈合[19]。含有PAD4 酶抑制剂的海藻酸-明胶甲基丙烯酰胺-支架可以抑制Cit-H3 表达，从而促进糖尿病小鼠创面愈合[20]。

皮肤伤口愈合是多因素共同参与，并高度协调、相互调控的复杂过程，包括止血、炎症、增殖和重塑四个阶段，涉及中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等多种细胞[21-22]。紫草具有凉血、活血、解毒透疹之功效，常用于治疗湿疹、皮炎、皮肤创面（疮疡、水火烫伤）及黏膜损伤等多种炎症性疾病。紫草素作为紫草的有效成分，通过抑制炎症介质的分泌，上调细胞因子如血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）、血小板衍生生长因子（PDGF）和表皮生长因子（EGF）的产生，促进成纤维细胞增殖和迁移。紫草素可通过TLR4/核转录因子-κβ(NF-κβ)信号通路抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症、下调氧化应激、降低半胱天冬氨酸酶-1(Caspase-1)活性抑制NLRP3 和AIM2 炎症小体的活化，发挥抗炎效应，促进人角质形成细胞和成纤维细胞增殖，有助于皮肤创伤愈合[7,23-25]。

中性粒细胞激活后，ROS 的生成是NETs 释放的关键[18]。PAD4 促使组蛋白上的精氨酸残基发生瓜氨酸化，这对于随后的染色质解聚和NETs 释放到细胞外环境中是必要的。本研究表明紫草素可抑制PMA 诱导的糖尿病小鼠中性粒细胞ROS 的生成，下调Cit-H3 水平从而抑制NETs 的生成，抑制炎症反应，来促进糖尿病创面愈合。

目前已知的靶向NETs 的药物主要是干扰NETs 结构和组分蛋白，包括DNase I、抗组蛋白抗体、PADs 抑制剂、NE 抑制剂以及ROS 清除剂等[26]。DNase I 只能清除已经生成的NETs，并不能从根本上阻止NETosis 的发生和蛋白水解导致的组织损伤[27]。PADs 抑制剂Cl-amidine 对PAD 缺乏选择性，体内半衰期短，活性相对较低、生物利用度有限且不良反应未知[28]。以NETs 为靶点的生物制剂具有稳定性差、制备复杂、价格昂贵等局限性，其治疗作用、毒性和耐药性仍有待大样本研究证实[29]。相比以上生物制剂，紫草素具有多靶点、多途径、疗效好、可持续、资源易得等优点[30]，有望作为NETs抑制剂用于糖尿病创面的治疗。

本研究结果提示，紫草素在体外可通过下调PMA 诱导的糖尿病小鼠骨髓来源的中性粒细胞ROS 水平，抑制Cit-H3 表达，从而抑制NETs 释放，发挥抗炎作用，提示紫草素可用于与NETs 相关的糖尿病足溃疡等疾病的治疗，为临床进一步开发应用紫草素提供了实验依据。