复方黄柏液涂剂抑制铜绿假单胞菌毒力因子表达的作用机制

杨伟峰，李金泽,2，崔开宇，李东影，李 露，王 毅

复方黄柏液涂剂由黄柏、连翘、金银花、蒲公英、蜈蚣组成，具有清热解毒、消肿祛腐之功效，临床上常采用湿敷法治疗糖尿病足、外伤感染等，可减少分泌物、减轻红肿疼痛、促进伤口愈合，疗效显著[1-2]，但其疗效的具体机制尚不明确。在这些临床复杂感染中，一个不容忽视的关键问题是细菌的毒力起到非常重要的作用[3-4]，而创面感染病原菌种类及其药物敏感性的改变是导致糖尿病足感染发生及影响预后的主要因素之一[5]。

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA 或PAO1)作为糖尿病足感染常见病原菌，在全部病原菌中占比约为10%～20%，且近年来呈明显上升趋势[6]；此外，PA 也是外科创面感染中是最常见的机会性致病菌之一[7]。其黏附力强，易形成生物膜，且可产生大量破坏宿主组织的毒力因子，如碱性蛋白酶、弹性蛋白酶、绿脓菌素、外毒素A 等[8]。这些受群体感应系统（quorum sensing，QS）调节的毒力因子，可以降解细胞外基质[9]，诱导细胞凋亡[10]，损害宿主免疫防御[11]，导致伤口愈合缓慢，在其致病过程中起到关键性作用。PA 还可通过依靠自身鞭毛和纤毛进行运动，并借助生物膜—浮游态转换导致感染扩散、毒素传播，致使病情恶化[12]。因此，PA 致病性与其表达和分泌的毒力因子直接相关，通过毒力因子进而促进铜绿假单胞菌在宿主体内的感染是其主要手段。由于抗生素的不合理使用以及自身的固有耐药，导致临床上多药耐药菌株的出现，使得免疫低下或患有特殊疾病的患者感染后很难治愈[13-14]，而面对PA 的耐药问题以及传统抗生素治疗效果的减弱，通过在非抑制细菌生长的条件下，采用降低细菌毒力因子表达，排除选择压力从而达到抑菌杀菌的作用已成为另一种治疗细菌感染性疾病的方式[15]。

本研究采用网络药理学结合实验验证的方法，首先检索并收集复方黄柏液各组分中的有效成分并预测其靶点，结合文献检索、耐药基因、毒力因子数据库筛选出抗PA 的潜在作用靶点，并构建“中药-成分-靶点”网络和蛋白质相互作用（PPI）网络，通过生物过程与通路富集分析，进一步探索复方黄柏液对PA 主要致病毒力因子及细菌生物膜的影响及作用机制，而后在结合网络分析结果的基础上，对其中涉及毒力因子的核心靶点进行实验验证，为临床采用复方黄柏液治疗PA 所致感染提供理论依据与参考。

1 材料与方法

1.1 复方黄柏液对PA 毒力因子表达和细菌生物膜影响的网络药理学研究

1.1.1 复方黄柏液成分收集与靶点预测 结合文献检索以及质谱分析数据[16]，收集复方黄柏液各组分中的化学成分，利用STITCH 和Pharmmapper 数据库对其成分进行靶点预测，其中STITCH 数据库以“Pseudomonas aeruginosa”为筛选条件进行靶点预测，并选取hight confidence，no more than 20 interactors 的作用靶点，Pharmmapper 数据库以“Pseudomonas aeruginosa”为筛选条件，选取Fit Score≥3 的作用靶点，对收集到的靶点通过Uniprot数据库进行标准化处理并整合去除重复值，最后结合文献及VFDB、CARD 数据库筛选得到复方黄柏液抗PAO1 的潜在作用靶点。

1.1.2 “中药-成分-靶点”网络构建 将整合好的化学成分与潜在作用靶点之间的相互关系编排成网络文本，并导入Cytoscape 3.7.2 软件（https://cytoscape.org/），利用“Network Analyzer”插件进行可视化分析，构建“中药-成分-靶点”网络图。

1.1.3 PPI 网络构建与核心靶点的筛选 将复方黄柏液抗PAO1 的潜在作用靶点导入STRING 数据库（http://string-db.org/）中的“Multiple Proteins”，选择物种“Pseudomonas aeruginosa PAO1”进行搜索，在“Settings”中选择置信度“medium confidence”和隐藏网络中断开连接的节点。更新数据后下载TSV 文本，并导入Cytoscape 软件中，利用“Network Analyzer”插件，在“Generate Style from Statistics”工具中选择“Degree”作为节点颜色大小的指标，“Combined_Score”作为边的颜色粗细的指标进行蛋白互作网络图的构建。然后根据度值（degree）大小，其次是介度中心性（betweenness centrality,BC）和接近中心性（closeness centrality,CC）大小筛选出核心靶点。

1.1.4 GO 生物功能与KEGG 通路富集分析 利用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对上述潜在作用靶点进行GO 富集和功能注释分析，选择物种“Pseudomonas aeruginosa PAO1”，查看其分析结果并绘制成气泡图。

1.2 复方黄柏液对PA 主要致病毒力因子影响的实验验证

1.2.1 实验菌株及药物 PAO1（ATCC 15692）购自美国模式培养物库。复方黄柏液涂剂：批号20031212，购自山东汉方制药有限公司；注射用头孢他啶（CAZ）：批号2004103，购自海南海灵化学制药有限公司。

1.2.2 主要试剂和仪器 XTT：批号C12592530，购自上海麦克林生化科技有限公司；PMS：型号P9625，购自美国Sigma 公司；MH 肉汤、胰蛋白胨、酵母提取物、细菌蛋白胨：购自美国Oxoid 公司；琼脂、氯化钠：购自国药集团化学试剂有限公司；假单胞菌分离琼脂：购自瑞楚生物科技（江苏）有限公司；结晶紫：购自美国Solarbio 公司；脱脂牛奶：购自美国BioRuler 公司；TTC：购自北京博奥拓达科技有限公司；LB 培养基：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，超纯水配制；LB 固体培养基：氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，琼脂20 g/L，超纯水配制；碱性脱脂牛奶琼脂平板：脱脂牛奶10 g/L、细菌蛋白胨1 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂20 g/L、pH=10；XTT-PMS 溶液：1 mg/mL XTT 与3.06 mg/mL PMS 按200∶1 混合，避光保存；0.4%CV溶液：结晶紫4 g/L，超纯水配制。SW-CJ-1FD 型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；THZ-D 型恒温振荡培养箱（苏州培英实验设备有限公司）；KBF-240 型恒温培养箱（德国Binder 公司）；V-1100 型紫外分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；Synergy H1 型酶标仪（美国BioTek 公司）；ELX50 型全自动八道洗板机（美国伯腾仪器有限公司）；Allegra X-15R 医用离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.2.3 体外药敏实验 参考马建凤[17]等实验方法，采用微孔板稀释法检测复方黄柏液对PA 的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。挑取PAO1 单菌落于4 mL LB 培养基，37 ℃、225 r/min振荡培养至细菌生长对数期，LB 培养基稀释菌悬液至OD600=0.02，取无菌96 孔板，采用微量稀释法将复方黄柏液和CAZ 进行倍比稀释，使复方黄柏液最终浓度为1/256～1/2 原液浓度，CAZ 最终浓度为0.0625～8 μg/mL，每孔含100 μL 稀释药液和100 μL稀释菌液，37 ℃培养24 h，每孔加30 μL TTC，室温培养30 min，观察颜色变化。实验重复3 次。

1.2.4 时间-生长曲线实验 参考刘静雪等[18]实验方法，连续动态挑取PAO1 单菌落于4 mL LB 培养基，37 ℃、225 r/min 振荡培养至细菌生长对数期，将菌悬液按照1∶100 接种到LB 培养基，37 ℃、225 r/min扩大培养0.5 h，加入倍比稀释药液，使复方黄柏液终浓度为1/8～1/2 原液浓度，CAZ 终浓度为0.125 μg/mL，同时设置不含药的空白对照组，37 ℃、225 r/min 振荡培养，每隔2 h 测定OD600值，观察24 h 并绘制生长曲线，实验重复3 次。

1.2.5 琼脂板测定复方黄柏液对PA 碱性蛋白酶的影响 参考Aybey 等[19]实验方法，挑取PAO1 单菌落37 ℃、225 r/min 振荡培养至细菌生长对数期，用10 μL枪头接种在碱性脱脂牛奶琼脂平板上，其中含1/4～1/16原液浓度的复方黄柏液培养基为实验组、不加药的培养基为空白对照组，含0.125 μg/mL CAZ 的培养基为阳性对照组，各浓度梯度设3 个重复，37 ℃培养24 h 后观察并测量各组透明圈的大小。

1.2.6 比色法测定复方黄柏液对PA 绿脓菌素的影响 参考Yang 等[20]实验方法，挑取PAO1 单菌落37 ℃、225 r/min 振荡培养至细菌生长对数期，取1 mL PAO1 菌液倒入制备好的假单胞菌分离琼脂平板，其中含1/2～1/16 原液浓度复方黄柏液的培养基为实验组、不加药的培养基为空白对照组，含0.125 μg/mL CAZ 培养基为阳性对照组，各浓度梯度设3 个重复。37 °C 恒温恒湿培养24 h 后，称取各平板中10 g琼脂，加入10 mL 氯仿，37 ℃震摇2 h，使绿脓菌素充分溶解，离心取5 mL 上清液并加入1 mL 0.2 mol/L HCL 振荡混匀，取上清液200 μL 测量OD520值。实验重复3 次。

1.2.7 微孔板法测定复方黄柏液对PA 成熟生物膜的影响 参考邢亚君等[21]实验方法，挑取PAO1单菌落，37 ℃、225 r/min 振荡培养至细菌生长对数期，LB 培养基稀释菌悬液至OD600=0.1，无菌96 孔板加稀释菌液每孔100 μL，37 ℃恒温恒湿培养24 h，洗去孔中的浮游菌，将药液进行2 倍稀释，使复方黄柏液最终浓度为1/4～1/16 原液，CAZ 最终浓度为0.125 μg/mL，各浓度梯度做3 个复孔，每孔加入100 μL 稀释药液，37 ℃继续培养24 h。用0.9%氯化钠溶液洗板2 次，分别加入0.4%CV 和XTTPMS 试剂，酶标仪检测总菌量（CV，590nm）和活菌量（XTT-PMS，450nm/655nm）的OD 值。实验重复3 次。

2 结果

2.1 复方黄柏液抑制PA 毒力表达和细菌生物膜的网络药理学预测分析

2.1.1 复方黄柏液有效成分及其潜在作用靶点筛选 通过文献检索及VFDB、CARD 数据库筛选得到复方黄柏液抗PAO1 的有效成分共62 个，潜在作用靶点共31 个，其中黄柏抗PAO1 潜在作用靶点8个，连翘潜在作用靶点9 个，金银花潜在作用靶点9个，蒲公英潜在作用靶点6 个，蜈蚣潜在作用靶点21 个，见表1。

表1 复方黄柏液各组分抗PAO1 的潜在作用靶点

2.1.2 “中药-成分-靶点”网络构建 将复方黄柏液有效成分与潜在作用靶点之间的相互关系编排成网络表格和属性表格，导入Cytoscape3.7.2 软件构建“中药-成分-靶点”网络，见图1。图1 中共98个节点，202 条边，其中节点的形状大小和透明度代表其相应的度值（degree），反映该节点与其他节点相互作用的程度，度值越大表示该节点在网络中的重要性越突出。从图1 中可以看出，黄柏所含Cynaroside、protocatechuic acid、γ-fagarine，连翘所含forsythenside A、forsythialan B、quercetin，金银花所含 Lonijaposide E、Lonijaposide B、Lonijaposide A，蒲公英所含 Caffeic acid ethyl ester、Chlorantholide A、Luteolin 及蜈蚣所含Alanine、Lysine、Arginine 等与多个靶点相互作用，提示这些化合物可能是复方黄柏液发挥抗铜绿假单胞菌作用的主要成分。同时靶点也与多个成分相互连接，显示了中药多成分，成分多靶点，协同发挥功效的特点。此外，利用“Network Analyzer”插件得到了度值较高的靶点信息，如algD、amiE、nirS、fptA、eta等，提示这些靶点可能是复方黄柏液中发挥抗PA作用的主要靶点。

图1 复方黄柏液中药-成分-靶点网络

2.1.3 PPI 网络构建与核心靶点的筛选 为了进一步明确复方黄柏液抗PAO1 靶点的相互作用关系，将筛选得到的31 个潜在作用靶点输入STRING 数据库中，设定物种为“Pseudomonas aeruginosa PAO1”进行检索，并将结果导入Cytoscape 软件进行可视化分析，构建PPI，如图2 所示。结果表明除pvcC、pagL、bphP、gshA、opdE、phzB2、mexR、kynA、fpvA 无交集靶点外，共得到22 个节点，30 条边。其中，节点的形状大小和颜色代表其相应的“degree”值，线条的粗细和颜色代表其相应的“combined score”值。节点由大到小，线条由粗到细，颜色由浅橙色到浅蓝色，表示相应的“degree”值和“combined score”值也由大到小。从图2 中可以直观地观察到phnW、lysC、aprA、glmS、murC、gbuA 等度值较大，提示这些可能是复方黄柏液抗PA 的关键靶点。

图2 复方黄柏液与PAO1 的PPI 网络

利用“Network Analyzer”插件，选择度值（degree）、介度中心性（BC）和接近中心性（CC）这3个重要参数作为核心靶点筛选的指标。结果选取排名前10 的靶点作为复方黄柏液抗PA 的核心靶点，依次为 phnW、lysC、aprA、murC、glmS、gbuA、eta、pvdA、adk、ftsZ，见表2。

表2 部分核心靶点基本信息

2.1.4 GO 富集分析与KEGG 通路注释分析 利用DAVID 数据库对31 个潜在作用靶点进行GO 分子功能、GO 生物过程、GO 细胞组分富集分析以及KEGG 通路注释分析（P＜0.05），将P值和基因富集数量比率进行排序，并将数据结果绘制成气泡图，结果显示，GO 富集分析共得到7 个条目，其中分子功能2 个，主要与丙氨酸消旋酶活性和磷酸吡哆醛结合有关；生物过程4 个，主要与铜绿假单胞菌铁载体（pyoverdine）生物合成过程、铁离子稳态、细胞壁组织、发病机制有关；细胞组分1 个，主要与细胞质有关。KEGG 通路注释分析共得到5 条信号通路，主要与D-丙氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、代谢途径、精氨酸和脯氨酸代谢和万古霉素耐药信号通路有关，见图3。

图3 GO 分子功能(A)、生物过程(B)、细胞组分(C)和KEGG 通路富集分析(D)

2.2 复方黄柏液影响PA 毒力因子的实验验证结果

2.2.1 复方黄柏液和CAZ 的MIC 及其对PAO1 的时间-生长曲线 体外药敏实验结果显示CAZ 对PAO1 的MIC 值为2 μg/mL，而复方黄柏液的MIC值则未能测出。时间-生长曲线结果显示，1/2～1/8原液浓度复方黄柏液和0.125 μg/mLCAZ 的生长曲线与空白对照组基本重合，提示1/2～1/8 原液浓度复方黄柏液对PAO1 生长无影响，见图4。

图4 复方黄柏液和CAZ 的PAO1 生长曲线

2.2.2 复方黄柏液对PAO1 碱性蛋白酶的影响 结合2.1 网络药理学预测分析及2.2.1 体外药敏实验和生长曲线结果，选择对PAO1 生长无抑制作用的1/4～1/16 原液浓度的复方黄柏液进行碱性蛋白酶测定，结果发现，与空白对照组相比，1/4～1/8 原液浓度的复方黄柏液可显著减小透明圈直径（P＜0.05），且随药物浓度的升高，所产生抑制作用增强的透明圈直径逐渐减小；而0.125 μg/mL CAZ 的透明圈无显著差异，见表3、图5。

图5 复方黄柏液对PAO1 碱性蛋白酶的影响

表3 复方黄柏液对碱性蛋白酶及绿脓菌素的影响

2.2.3 复方黄柏液对PAO1 绿脓菌素的影响 与空白组相比，阳性对照0.125 μg/mL CAZ 组对绿脓菌素无抑制作用；而1/4～1/16 浓度的复方黄柏液可以有效地抑制绿脓菌素产生（P＜0.01），其抑制率分别为41.15%、10.67%、16.88%，见表3。

2.2.4 复方黄柏液对PAO1 成熟生物膜的影响 与空白组相比，1/8～1/16 原液浓度的复方黄柏液可显著抑制成熟生物膜的生物总菌量和膜内活菌量（P＜0.01），1/4 原液浓度的复方黄柏液可显著抑制成熟生物膜的生物总菌量（P＜0.01）；0.125 μg/mL CAZ 对PAO1 生物膜总量和活菌量也有明显抑制作用（P＜0.01），见图6。

图6 复方黄柏液对PAO1 成熟生物膜总量和活菌量的影响

3 讨论

本研究首先基于网络药理学对复方黄柏液有效成分进行靶点预测，找到抗PA 潜在作用靶点31个，并根据度值得到phnW、lysC、aprA、murC、glmS、gbuA、eta、pvdA、adk、ftsZ 等核心靶点。有研究表明，phnW、murC、ftsZ 等靶点涉及细菌细胞壁合成、耐药、细菌分裂等方面。其余靶点多与细菌毒力因子调控相关，其中碱性蛋白酶（aprA）是PA 主要的毒力因子之一，它可以降解宿主蛋白并抑制中性粒细胞功能，还能促进另一种毒力因子—绿脓菌素的产生[22]。此外，gbuA 靶点也与QS 系统调控的绿脓菌素表达密切相关[23]。有研究表明，lysC 和adk 的失活可以抑制浮游菌向生物膜的转变，是治疗PA 生物膜相关的良好靶点[24]。因此，根据预测结果靶向分析，本研究选择碱性蛋白酶、绿脓菌素、生物膜指标进行检测，其结果也验证了复方黄柏液可以有效地抑制这些毒力因子表达。

通过对潜在作用靶点进行GO 富集和KEGG通路注释分析，发现在细胞组分中31 个潜在作用靶点主要分布在细胞质，分子功能的丙氨酸消旋酶活性和磷酸吡哆醛结合主要与细胞壁的重要成分D-丙氨酸合成相关。现已证实当丙氨酸消旋酶活性受到抑制后会干扰细胞壁的合成，从而起到抗菌作用[25]。生物过程预测结果提示复方黄柏液有效成分可能与PAO1 的铁载体pyoverdine 生物合成过程及其铁离子稳态、细胞壁组织、发病机制有关，其中铁载体pyoverdine 是PAO1 获取铁离子的主要方式，它能够使自身免受活性氧（ROS）的威胁，还可以调控生物膜的形成，是引发疾病的重要毒力因子[26-27]。KEGG 通路注释分析提示复方黄柏液与PAO1 的丙氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、代谢途径、精氨酸和脯氨酸代谢和万古霉素耐药信号通路有关，上述可能是复方黄柏液抗PAO1 的主要代谢通路。

对网络药理学靶点预测结果进行实验验证的结果表明，复方黄柏液在低于1/2 原液浓度下对PAO1 的生长无抑制作用。在不影响细菌生长浓度下的复方黄柏液可以有效地抑制PA 主要致病毒力因子碱性蛋白酶和绿脓菌素的表达。此外，低于1/2原液浓度的复方黄柏液可不同程度抑制PA 成熟生物膜总量及膜内活菌量。头孢他啶作为第3 代头孢菌素类抗生素，为临床治疗PA 感染的一线用药，在本实验中发现其对成熟期生物膜也有较好的抑制作用，与以往报道结果一致[28-29]，但对PA 主要致病毒力因子如碱性蛋白酶、绿脓菌素等并无抑制作用。相比于经典抗生素，复方黄柏液因其对病原菌生长无影响，可有效缓解由于药物选择压力而出现的细菌耐药性；同时还可有效抑制毒力因子，因而减轻疾病过程中毒力因子引起的机体损伤、促进组织愈合。

复方黄柏液由黄柏、连翘、金银花、蒲公英、蜈蚣组成，已有研究表明黄柏、连翘等清热解毒类中药可以不同程度地降低PA 毒力因子的表达，抑制生物膜形成以及集群运动[18,30]，这可能是复方黄柏液中发挥抑制PA 主要致病因子（碱性蛋白酶、绿脓菌素等）的主要有效成分。本研究网络药理学潜在作用靶点筛选结果提示复方黄柏液中所含的金银花、蒲公英、蜈蚣等也可能具有相应作用，有待进一步深入研究。

综上，对于临床PA 所致的感染创面，复方黄柏液在其中作为一种非杀菌剂，通过抑制PA 主要致病毒力因子碱性蛋白酶、绿脓菌素表达，抑制成熟细菌生物膜的细菌总量和活菌量，在临床广泛用于治疗糖尿病足、外伤感染等治疗。