膀胱癌组织中高迁移率族蛋白B1、DJ-1 的表达及其临床意义研究

赵 朋，杨 拓，王金铸，蔡科科，刘立朋，刘 鹏，白铁男，念学武

膀胱癌是泌尿系统较常见的恶性肿瘤，尤以男性患者多发。据统计，世界范围内男性膀胱癌的发病人数占男性新发恶性肿瘤总数的4.4%，居癌症疾病谱第6 位[1]。膀胱癌细胞的侵袭和转移是患者死亡的主要原因。高迁移率族蛋白B1 (high mobility group box 1, HMGB-1)基因定位于13q12，其编码蛋白为染色质蛋白，广泛存在于人体组织中，主要参与调控各种细胞的生存和死亡，且在肿瘤的细胞增殖、血管形成、侵袭、转移等生物学行为中发挥着重要作用[2]。帕金森病相关蛋白（DJ-1）的编码基因定位于人类染色体1P36.2～1P36.3，是一种新的丝裂原依赖的癌基因，其主要参与肿瘤细胞DNA 的转录调节和线粒体调节，在肿瘤的发生、发展过程起着关键作用[3]。目前有关HMGB-1、DJ-1在膀胱癌中的表达和肿瘤的侵袭与预后相关性的研究较少。本研究采用免疫组化方法检测浸润性膀胱癌及同源癌旁组织中的HMGB-1、DJ-1 表达水平，探讨其表达水平与肿瘤侵袭、转移及预后的相关性，为膀胱癌预后判定及围手术期治疗方案的选择提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2005 年1 月—2015 年1 月天津医科大学第二医院和天津市南开医院收治的58 例膀胱癌患者，均经影像学检查、膀胱镜、肿瘤细胞学和术后病理确诊，排除术前有膀胱癌电切术史、化疗、放疗或其他抗肿瘤治疗史的患者。58 例膀胱癌患者中男33 例，女25 例；年龄52～81 岁，平均（68.0±9.6）岁。按照国际抗癌联盟制定的病理TNM分期标准对所有患者进行分期，其中Ⅰ期8 例，Ⅱ期19 例，Ⅲ期16 例，Ⅳ期15 例。58 例非肌层浸润性及肌层浸润性膀胱癌组织为研究标本，距离癌灶5 cm 的癌旁组织为对照标本。

1.2 免疫组化SABC 法检测HMGB-1、DJ-1 表达水平 应用武汉博士德生物工程公司提供的兔抗人HMGB-1 多克隆抗体，兔抗人DJ-1 多克隆抗体，广谱SABC 免疫组化试剂盒、抗原修复液和DAB 显色试剂盒，采用SABC 染色方法，将膀胱癌组织分别进行超薄切片，脱蜡处理后，加入一抗兔抗人HMGB-1 多克隆抗体，兔抗人DJ-1 多克隆抗体，工作浓度均为1∶100，DAB 显色，用已知的乳腺癌阳性切片作为阳性对照。每张切片在光镜下读取5 个有代表性的高倍镜视野（×400），记录500 个膀胱癌细胞和癌旁上皮细胞。HMGB-1 阳性结果的判定：1）胞质内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性计数标本；2）没有染色或<1%的胞质染色为阴性（-）；3）1%～10%的细胞质染色为弱阳性（+）；4）11%～50%的细胞质染色为阳性（++）；5）≥50%的细胞质染色为强阳性（+++）。DJ-1 阳性结果判定按照肿瘤细胞的染色比例分级以伴或不伴胞质染色的胞核内出现棕色或棕黄色颗粒作为DJ-1 阳性细胞的判定：1）染色细胞数≤10%为阴性（-）；2）染色细胞数占11%～25%为弱阳性（+）；3）染色细胞数占26%～50%为阳性（++）；4）染色细胞数>50%为强阳性（+++）。58 例膀胱癌患者同时行HE 染色，观察上皮细胞内异型细胞数量，细胞分裂象，细胞核质比，核染色及癌巢，进一步判定肿瘤的病理分级和恶性生物学行为。

1.3 统计学处理 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，HMGB-1 和DJ-1 蛋白的表达情况以例（%）表示，比较采用χ2检验，采用Spearman 等级相关分析HMGB-1 与DJ-1 表达的相关性；采用Kaplan-Meier 法分别描绘HMGB-1 和DJ-1 蛋白阳性及阴性患者的生存曲线，并采用Log-rank 法进行比较；采用Cox 回归分析膀胱癌预后的危险因素，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGB-1、DJ-1 蛋白染色结果比较 SABC 染色结果显示，HMGB-1 呈棕褐色表达位于膀胱癌细胞及癌旁上皮细胞质内（图1A、1B）。膀胱癌中HMGB-1 阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）。DJ-1 蛋白在以上两组中的表达呈粗细均匀的棕黄色颗粒，且在胞质中几乎无表达，主要定位于细胞核（图1C、1D）。癌旁组织中可见细胞核染色较浅，出现少量异型性细胞，核质比正常，细胞形态清晰。膀胱癌细胞中上皮细胞核深染，出现明显癌巢，细胞分裂象明显，核质比异常（图1E、1F）。膀胱癌中DJ-1 阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 HMGB-1、DJ-1 在不同组织中的免疫组化表达情况

图1 膀胱癌和癌旁组织中HMGB-1、DJ-1 蛋白的表达

2.2 HMGB-1、DJ-1 与膀胱癌临床病理特征的关系 58 例膀胱癌中，HMGB-1 与病理分型、病理分级、淋巴结转移、TNM 分期有关（P<0.05），肿瘤分化越差、淋巴结有转移、分期越高，HMGB-1 蛋白表达水平越高。DJ-1 在58 例膀胱癌中的表达与肿瘤数目、淋巴结转移、TNM 分期有关（P<0.05），肿瘤多发、分期越高、淋巴结有转移，DJ-1 蛋白表达水平越高（表2）。

表2 膀胱癌患者不同临床特征与HMGB-1、DJ-1 表达的相关性

2.3 膀胱癌中HMGB-1 与DJ-1 表达的相关性 58例膀胱癌患者中，HMGB-1 阳性表达37 例，阳性表达率为63.8%；DJ-1 阳性表达40 例，阳性表达率为69.0%。经Spearman 相关分析显示，HMGB-1 与DJ-1 表达呈正相关（r=0.421，P<0.001，表3）。

表3 膀胱癌中HMGB-1 和DJ-1 表达的相关性分析

2.4 HMGB-1、DJ-1 蛋白的表达与膀胱癌患者生存的关系 58 例膀胱癌患者的5 年无瘤生存率为46.55%（27/58）。HMGB-1 蛋白高表达者的5 年无瘤生存率为45.94%（17/37），低于HMGB-1 蛋白低表达者的5 年无瘤生存率95.23%（20/21），差异有统计学意义（χ2=16.236，P=0.001），图2A）。DJ-1 蛋白高表达组的5 年无瘤生存率为55.0%（22/40），低于低表达组的5 年无瘤生存率83.33%（15/18），差异有统计学意义（χ2=5.586，P=0.018，图2B）。

图2 HMGB-1（A）、DJ-1（B）蛋白的表达与膀胱癌患者生存曲线的关系

2.5 影响膀胱癌患者预后的Cox 多因素分析 Cox多因素分析结果显示，HMGB-1 和DJ-1 阳性、腺癌、鳞癌、病理分级高、有淋巴结转移、TNM 分期高是膀胱癌患者预后的独立危险因素（表4）。

表4 影响膀胱癌患者预后的Cox 多因素分析结果

3 讨论

全球每年大约有45 万例新增膀胱癌患者，发病率及死亡率均呈增高的趋势[4]。在所有新确诊的膀胱癌患者中，大约70%的病例是非肌肉浸润性膀胱癌，肌层侵润性膀胱癌的发病率仅占30%。近年来，随着新型冠状病毒感染（COVID-19）的大规模的流行，感染新型冠状病毒的膀胱癌患者的死亡率激增。Akan 等[5]研究指出，高危非肌肉浸润性膀胱癌患者接受膀胱卡介苗灌注治疗后出现COVID-19 感染的风险更高。因此，膀胱癌的早期诊断可以显著降低患者的死亡率。膀胱镜是检查膀胱癌的主要检测方式之一，但是由于存在一定的假阴性率，且侵入性操作会造成患者的心理压力过大，而使得部分患者难以接受此项检查。尿液细胞学等非侵入性检测的敏感性较低，在一定程度上限制了临床广泛使用。本研究旨在探究膀胱癌新的分子标志物，以期能够为临床诊疗和预后判断拓宽新的思路。近年来，肿瘤分子标志物用于膀胱癌分子分型、浸润、转移、预后评估与靶向分子治疗的选择具有重要的意义。

HMGB-1 蛋白在肿瘤的形成、发生和发展中发挥着重要作用，不仅参与肿瘤细胞发生、增殖，还与肿瘤细胞的侵袭能力、淋巴转移等机制有关[6-7]。Takaki 等[8]发现胃癌组织HMGB-1 的表达显著高于癌旁组织。其中HMGB-1 主要生物学作用是通过RAGE/ERK/NF-κB 通路的相互作用来转导细胞信号而调节胃癌细胞的增殖及迁移能力。已知DJ-1基因在肝细胞癌[9]、食管癌[10]、子宫内膜癌[11]、结直肠癌[12]等多种恶性肿瘤中表达异常升高，DJ-1 基因的异常表达在抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、转录水平的调节、肿瘤侵袭和转移等方面起着重要作用。

本研究采用SABC 染色法检测膀胱癌HMGB-1 和DJ-1 蛋白的表达情况，发现HMGB-1 在膀胱癌组织的表达水平及增殖能力显著高于癌旁组织，表明HMGB-1 对膀胱癌细胞的增殖与侵袭具有促进作用，这与Takaki 等[8]研究报道观点一致。研究还证实HMGB-1 的表达与肿瘤病理分级有关，高分级肿瘤的侵袭、转移能力显著高于低分级肿瘤；其表达量的高低反映细胞增殖能力的强弱，即肿瘤分级越高，HMGB-1 的表达量越高。HMGB-1 蛋白的表达水平与TNM 分期相关，在Ⅲ～Ⅳ期膀胱癌发生淋巴结转移的患者中HMGB-1 蛋白表达率显著增高，这与Yang 等[13]的研究结果一致；有学者研究发现使用siRNA 下调胃癌细胞内HMGB-1 后，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力均降低[14]。本研究发现DJ-1 蛋白在膀胱癌组织中呈高表达状态，在癌旁组织中几乎不表达，表明DJ-1 蛋白高表达与膀胱癌浸润、病理分级、临床分期及预后密切关联；本研究结果还发现，HMGB-1 与膀胱癌分型有关，即其表达水平在鳞癌和腺癌中显著高于尿路上皮癌，但具体机制仍需进一步探索。本研究还发现HMGB-1 高表达者的生存期低于低表达者，HMGB-1 高表达是患者不良预后的危险因素。HMGB-1 在膀胱癌中表达及预后的关系与其在肝细胞癌中的表达一致，有研究对208 例肝细胞癌临床样本分析，其中134 例（64.4%）肝细胞癌患者HMGB-1 呈过度表达状态，且HMGB-1 的过度表达与患者预后不良显著相关，高表达者生存期普遍较短[15]。

综上所述，HMGB-1 和DJ-1 在膀胱癌组织中的表达上调与膀胱癌细胞的增殖、侵袭、转移和预后密切关联。HMGB-1 和DJ-1 蛋白的表达在膀胱癌发生与进展中起着协同促进作用。提示联合检测HMGB-1 和DJ-1 的表达水平有望为预测肿瘤浸润进展、肿瘤预后评估和围手术期治疗方案的选择提供参考依据。