探讨益智仁调节脂质代谢对糖尿病肾病小鼠的保护作用

倪雅丽，姚宇剑，武 素，谢毅强

（1.海南省第二人民医院药学部，海南 五指山 572200；2.海南省中医院医务部，海南 海口 570203；3.海南省中医院内分泌科，海南 海口 570203；4.海南医学院中医学院，海南 海口 571199）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是全球发病率和导致死亡率增加的主要疾病之一。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最严重的肾脏并发症，是引起终末期肾病的最主要原因之一［1-3］。DN 发病的分子机制复杂多样，目前尚未完全阐明［4，5］。益智仁（FructusAlpiniae oxyphyllae），性味辛，性温，入肾、脾经，是补肾温肾之良药，同时又长于固涩缩尿，辛而不循经走窜，温而不燥，具有温脾止泻摄涎，暖肾缩尿固精之功效。临床常用于遗尿，遗精，肾虚等症，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎及抗应激等方面的作用。前期研究发现，益智仁可以明显降低DN 小鼠血糖浓度、过氧化氢及超氧阴离子含量，减少尿白蛋白排泄量，改善肾脏功能，调节肠道微生物的丰富度［6，7］。

代谢组学可以识别特定生理和病理条件下的特异性分子标记物，并可用于研究代谢性疾病的发病机制和治疗药物的作用机制。研究表明，以代谢组学为基础的研究可以阐明中医药治疗DN 的部分作用机制［8-10］。网络药理学是建立在系统生物学理论基础上的一门新兴学科，是传统医学现代研究的新方法和重点之一，并在分子和系统水平上提供关于单一草药或潜在处方的生物活性成分及其作用机制的丰富信息［11］。因此，基于上述原理采用网络药理学及代谢组学技术，筛选益智仁治疗的DN 相关潜在生物标志物及代谢通路，系统性的分析益智仁治疗DN 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物及动物

益智仁，购自海南同仁堂药业有限公司。厄贝沙坦片（安博维），购自赛诺菲（杭州）制药有限公司，批号：9A275。实验小鼠［生产许可证：SCXK（苏）2015-0001，批号T002407］，由南京动物研究所提供。

1.2 试剂

尿素氮测试盒（批号C013）、尿肌酐测定试剂盒（批号C011），上述试剂均购自南京建成生物工程研究所。尿白蛋白试剂盒（批号ml037573），购自上海酶联生物科技有限公司。甲醇（CAEQ-4-003302-4000）、甲酸（CAEQ-4-014784-0500）、乙腈（CAEQ-4-000308-4000）均购置CNW 公司。L-2-氯苯丙氨酸（14091-11-3），购自上海恒创生物科技有限公司。

1.3 仪器

血糖仪（强生，英国）；全波长酶标仪（BioDeKInstruments，Inc.）；冷 冻 离 心 机（Eppendorf）；移液枪（Eppendorf，Germany）；恒温水浴锅（蓝天化验仪器厂，杭州）；恒温箱（思昊科学仪器，湖北）；全自动样品快速研磨仪（净信实业发展有限公司，上海）；超声波清洗机（新芝生物科技有限公司，宁波）；漩涡振荡器（汗诺仪器有限公司，上海）；高分辨质谱仪（Waters）；高效液相色谱仪（Waters）；色谱柱（Waters）。

1.4 “药物-成分-靶点-疾病网络图”构建

以“益智仁”为检索词，于TCMSP 在线数据（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中检索主要活性成分及其相应的靶点。以“Diabetic nephropathy”为检索词，应用Genecards（https：//www.genecards.org/）检索疾病相关基因。使用在线工具Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）筛选益智仁治疗DN 的作用靶点，并运用Cytoscape 3.7.2 软件构建“药物-成分-靶点-疾病网络图”。

1.5 基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析

将益智仁治疗DN 的作用靶点输入Omicshare在线工（https：//www.omicshare.com/tools/），选择物种“Homo sapiens”，查找益智仁治疗DN 的信号通路，并将信号通路进行注释分析。

1.6 药物制备、小鼠分组及DN 小鼠造模

实验室制备浓度为0.25 g/mL 益智仁水煎液及1.67 mg/mL 厄贝沙坦水溶液。小鼠分为4 组，其中DB-/DB-小鼠8 只一组；db-/db-小鼠24 只，随机分为3 组，每组8 只。所有小鼠置于温度为（22±1）℃与相对湿度为50%±5%环境中饲养，光照周期为12 h，给予无限的水喂养。DB-/DB-小鼠给予普通饲料喂养。db-/db-小鼠为自发型2 型糖尿病小鼠，给予高糖高脂饲料饲养4～5 周后，小鼠明显出现肥胖，8～9 周出现微量白蛋白尿。空腹血糖＞16.7 mmol/L（强生血糖仪）、24 h 尿白蛋白含量≥20 mg的为DN 小鼠模型。DN 小鼠造模成功后分为3 个组，分别为益智仁组（db-/db-Y）、厄贝沙坦组（db-/db-IRB）及生理盐水组（db-/db-S）；益智仁灌胃剂量（预实验）与厄贝沙坦灌胃剂量（人与小鼠剂量换算公式：小鼠的剂量＝9.1×人的剂量mg/kg）分为1.5 mg/g 与0.01 mg/g，灌胃量大约为0.2 mL 左右；正常组与生理盐水组给予相应体积的生理盐水。连续灌胃8 周。

1.7 尿素氮、尿肌酐及尿白蛋白按试剂盒说明书测定。

1.8 PAS 染色

肾脏制成石蜡切片→石蜡切片脱蜡→至蒸馏水水洗，过碘酸酒清液10 min→自来水冲洗10 min后，Schiff 氏液染色10 min→流水冲洗5 min，用哈瑞苏木精染核3 min→流水冲洗5 min，常规脱水、透明、封固。

1.9 粪便样品的预处理

1.9.1 称取60 mg 粪便，向粪便中加入20 μL 的L-2-氯苯丙氨酸、20 μL 的Lyso PC17：0 与600 μL 的甲醇∶水（V∶V=4∶1）。

1.9.2 样品中加入小钢珠，在-20 ℃冰箱中放置2 min 预冷，放入研磨机（60 Hz，2 min），超声提取10 min，随后将样品静置于-20 ℃冰箱中30 min。

1.9.3 将样品从冰箱中取出，置于离心机上，13 000 r/min，4 ℃，离心10 min，移液枪吸取200 μL 上清液，使用0.22 μm 的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC 进样小瓶，进行LC-MS 分析。

备注：所有提取试剂使用前均在-20 ℃进行预冷。

1.10 色谱条件及质谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 um）；流动相为 A-水（含0.1%甲酸），B-乙腈（含0.1%甲酸）。柱温 45 ℃，流速 0.4 mL/min，进样体积2 μL。质谱条件：电喷雾离子源，样品质谱信号采集分别采用正负离子扫描模式。

1.11 统计学处理

尿素氮、尿肌酐、尿白蛋白等数据用SPSS16.0软件进行统计学分析，结果以（±s）表示，P＜0.05有统计学意义。代谢产物用UNIFI 1.8.1.软件采集原始数据，采集的数据用SIMCA 软件包处理；两组多元统计分析比较用PLS-DA 分析分析。采用Omicshare 数据库（http：//www.omicshare.com），将P值和Fold change 进行可视化处理。通过Metabo-Analyst 5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）将 筛选到的差异代谢产物富集相应的代谢通路。

2 结果

2.1 小鼠尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量

给药8 周后，测定各组小鼠尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量，结果如表1 所示。与正常组相比，生理盐水组24 h 尿液中的尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量均显著升高（P＜0.01 或P＜0.001）；与生理盐水组相比，厄贝沙坦组和益智仁组小鼠24 h 尿液中的白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组小鼠尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量（n=8，M/24 h，±s）Tab 1 Contents of urinary albumin，urea nitrogen and creatinine in mice of each group（n=8，M/24 h，±s）

表1 各组小鼠尿白蛋白、尿素氮及尿肌酐含量（n=8，M/24 h，±s）Tab 1 Contents of urinary albumin，urea nitrogen and creatinine in mice of each group（n=8，M/24 h，±s）

注：与生理盐水组比*P＜0.05、**P＜0.01；与正常组相比##P＜0.01、###P＜0.001。

组别正常组厄贝沙坦组益智仁组生理盐水组尿白蛋白0.09±0.01 0.17±0.02**0.38±0.02**1.12±0.04##P—P—P—0.003 0.007 0.000 0.002 0.003 0.001尿素氮19.17±1.27 29.35±3.36**31.16±4.90*56.89±6.20###0.001 0.017 0.000尿肌酐5.84±1.93 11.78±1.74**9.54±2.01**22.81±2.34###

2.2 肾脏切片

结果如图1 所示，给药灌胃8 周后，与正常组相比，生理盐水组可见肾小球弥漫性系膜扩张伴系膜细胞增殖；与生理盐水组相比，益智仁组与厄贝沙坦组可见肾小球系膜细胞增生及系膜扩张相对减少。

图1 肾脏病理切片PAS 染色（箭头处为肾小球）Fig 1 PAS staining of renal pathological section （the arrow is glomerulus）

2.3 “药物-成分-靶点-疾病网络图”的构建与分析

结果如图2 所示，益智仁共筛选出治疗DN 的4个有效成分及其28 个作用靶点。粉色六边形表示4种有效成分，分别是胡萝卜素（Daucosterol）、谷甾醇（sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）及谷甾醇棕榈酸酯（sitosterol palmitate）。蓝色圆形表示28 个作用靶点，包括NFKB1、BAX、PTGS1 及PTGS2 等。每种活性成连接多个靶点，多个靶点也连接多种成分，侧面表明益智仁多成分、多靶点治疗DN 的作用特点。

图2 “药物-成分-靶点-疾病”网络Fig 2 ＂Drug-component-target-disease＂ network

2.4 KEGG 通路富集分析

KEGG 通路富集分析共筛选出与28 个作用靶点相关的43 条通路（P＜0.05），

剔出P值较小排名靠前的癌症及其他疾病等假阳性相关通路，并绘制排名前20 的KEGG 富集分析气泡图，主要涉及的信号通路有：NF-κB 信号通路、TNF 信号通路、鞘脂信号通路及细胞凋亡等，见图3A。将富集的43 条相关通路进行注释分析，其中与代谢作用相关的为脂质代谢、辅因子和维生素代谢、外源生物降解与代谢及其他物质的代谢等，见图3B。查阅文献［12］，笔者认为脂质代谢是益智仁治疗DN 过程中主要的代谢途径之一。

图3 益智仁治疗DN 作用靶点KEGG 富集分析气泡图（A）及KEGG 富集通路注释分析柱状图（B）Fig 3 Bubble diagram （A）and annotation histogram （B）of KEGG pathways enriched by the potential targets of Yizhien in the treatment of DN

2.5 益智仁组与DN 组代谢产物初步分析

对实验小鼠粪便质谱信息进行PCA 和PLSDA 多元统计比较。PCA 得分图中模型组和益智仁组粪便样品分别聚集在一起，结果见图4A。PLSDA 图中2 组样本呈现较好的聚类效果，2 组明显区分，结果见图4B。上述结果均表明两组样本之间的存在代谢差异。

图4 PCA（A）与PLS-DA（B）Fig 4 PCA（A）and PLS-DA（B）

2.6 益智仁组与DN 组差异代谢产物的分析

采用OPLS-DA 分析，根据VIP＞1 及t检验中P＜0.05 的条件，共筛选出益智仁组与DN 组潜在的584 个差异代谢物，包括磷脂酰胆碱PC（16∶0/0∶0）、溶血磷脂酰胆碱LysoPC（18∶1（9Z））及磷脂酰甘油PG（21∶0/0∶0）等。结果如图5 所示，通过变量权重值（VIP 值），将VIP 值排名前30 对差异代谢物表达量进行可视化分析，VIP 值越大，表明该代谢产物在两组中造成的影响越大。

图5 VIP 值排名前三十的差异代谢产物热图Fig 5 Heatmap of differential metabolites in the top 30 VIP values

2.7 益智仁组与生理盐水组差异代谢产物的代谢通路途径分析

运用MetaboAnalyst 5.0 在线数据库，构建差异代谢产物的相应代谢途径，筛选符合影响值＞0.10且-log（P）＞1.5 为条件的代谢途径作为潜在靶标代谢途径。结果如图6 所示，鞘脂代谢影响值与-log（P）值为0.154、2.355，甘油磷脂代谢影响值与-log（P）值为0.216、1.697，表明DN 小鼠模型代谢紊乱主要与鞘脂代谢与甘油磷脂代谢途径有关。结合差异代谢产物分析结果，鞘脂代谢与甘油磷脂代谢途径中包含的代谢产物主要为鞘磷脂、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺。与生理盐水组相比，这4 种代谢产物在益智仁组中的均显著下降（P＜0.01，P＜0.001 或P＜0.0001），结果如图7所示。

图6 DN 相关代谢途径Fig 6 DN-related metabolic pathways

图7 4 种代谢产物在两组中的含量差异Fig 7 The content difference of four metabolites in two groups

3 讨论

DN 的特征是进行性肾脏功能减弱与肾小球滤过率（GFR）＜60 mL/min/per1.73 m2。DN 常规诊断方法主要包括尿白蛋白排泄率增加、肾小球滤过率下降及肾脏病理发生变化等。本研究通过测定24 h 尿液中尿白蛋白、尿肌酐、尿素氮含量及观察肾脏病理变化进行疗效评价，发现益智仁能显著降低模型小鼠24 h 尿液中尿蛋白、尿肌酐及尿素氮排泄量，并且能减少模型小鼠肾小球系膜细胞增生及系膜扩张。

“药物-成分-靶点-疾病网络图”分析结果表明，益智仁治疗DN 的相关基因为28 个，分别为NR3C1、BAX、KL及PTGS2等。糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，NR3C1），主 要 位 于 肾 小球、近端小管和髓袢升支粗段，存在于内皮细胞、足细胞、系膜细胞和内皮细胞。研究发现，内皮NR3C1 的缺失加速糖尿病肾病的发展，足细胞NR3C1 体对于糖尿病患者的肾小球内皮细胞稳态至关重要［13，14］。促凋亡蛋白（Bax）是Bcl-2 家族的成员，是细胞凋亡内在途径的核心调节因子，在高糖诱导的足细胞中，Bax 表达水平明显上调［15］。KLKlotho（KL）为一种抗衰老分子，主要在肾脏和大脑的脉络膜丛中表达，KL 过表达可能对治疗糖尿病和糖尿病肾病具有潜在的治疗作用［16］。PTGS2 又称环氧化酶-2（COX-2），是花生四烯酸合成前列腺素的关键基因。Singh 等［17］发现，抑制COX-2 上调可以改善糖尿病肾病大鼠疾病状态。

KEGG 通路富集分析结果发现，脂质代谢是益智仁治疗DN 过程中主要的代谢途径之一。代谢组学分析结果显示的鞘脂代谢与甘油磷脂代谢途径也证实了这一观点。基于益智仁组与DN 组差异代谢产物分析，上述代谢途径中包含的代谢产物主要为鞘磷脂、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺，且模型组小鼠在益智仁给药后，这四种代谢产物含量均有显著下降。代谢产物会随着肾脏损伤的进程发展而变化，进而成为新的敏感性生物标记物。鞘磷脂是真核生物膜磷脂的主要成分之一，与磷脂酰胆碱一起构成50%以上的膜磷脂。有报道称，鞘磷脂调控炎症、脂肪组织功能、肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化等相关疾病的发展［18，19］。研究表明，高鞘磷脂水平可能导致肾脏疾病的发生和发展，增加患终末期肾病的风险［20］。磷脂酰胆碱是细胞膜的主要成分，是脂质第二信使的来源和细胞周期进展的决定因素，在体内具有多种生物活性，如抗炎［21］、改善脑功能［22］及调节脂蛋白稳态［23］等作用。研究发现，与正常组相比，DN 组小鼠代谢物磷脂酰胆碱含量显著升高［24］。溶血磷脂酰胆碱是磷脂酰胆碱裂解形成的脂质生物分子，通过G 蛋白偶联受体信号通路对多种细胞产生有害影响，包括增强炎症反应、诱导细胞凋亡和胰岛素抵抗等［25］。DN 患者出现肾功能障碍的快速进展与溶血磷脂酰胆碱增加有关，溶血磷脂酰胆碱通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体δ 引起脂滴积聚，进而引起脂滴包被蛋白Perilipin 2 的上调和自噬通量的减少，从而导致近端肾小管细胞器应激和细胞凋亡［26］。磷脂酰乙醇胺是真核细胞中含量排名第二的甘油磷脂，功能上与蛋白质生物发生和活性、氧化磷酸化、自噬、膜融合及线粒体稳定有关，并且是其他脂质的重要前体。研究发现，磷脂酰乙醇胺是促进早期糖尿病肾损害的代谢产物，与非糖尿病对照组相比，糖尿病患者肾小球和肾小管中的磷脂酰乙醇胺水平显著增加［27］。

综上所述，本研究采用网络药理学结合代谢组学技术，进一步揭示益智仁治疗DN 的效应物质、作用靶点、代谢产物及代谢通路，充分体现了益智仁治疗DN 多成分、多靶点、多途径的作用特点。该方法为今后益智仁治疗DN 的研究提供了科学依据。

作者贡献度说明：

倪雅丽：负责实验设计、数据处理及文章撰写；姚宇剑、武素：负责中医药理论解释、动物造模、样本采集及检测；谢毅强：负责实验思路及最终文章的修改。

所有作者声明不存在利益冲突关系。