纳米紫杉醇磁流体热化疗对肺癌细胞的抑制作用

莫斯柯 黄丽霞 郑晶 魏东山 胡润磊*

目前，我国肺癌的发病率仍居恶性肿瘤首位［1］。其治疗以手术治疗、化学治疗以及放射治疗为主，免疫治疗、靶向治疗及中医中药治疗也成为肺癌研究的前沿［2-3］。磁流体热疗（magnetic fluid hyperthermia，MFH）是将磁流体通过直接注射至肿瘤部位或动静脉注射的方式到达肿瘤区域，外加交变磁场（alternating magnetic field，AMF）作用，能够将电场的能量集中到磁流体聚集的特定部位并升至一定温度，从而通过变性、折叠和蛋白质聚集等方式［4］杀死癌细胞，而周围正常组织无磁流体的分布，不产生升温效果，因而具有高度的靶向性［5］。此外，纳米磁流体还可以作为靶向治疗的载体［6］，通过外部磁场梯度引导其到特定的靶区域，从而实现药物的靶向运输［7］。我国率先将磁流体与肺癌一线化疗药物—紫杉醇，通过特定的方法共聚合成纳米紫杉醇磁流体。本文探讨纳米紫杉醇磁流体热化疗治疗肺癌的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料及动物 （1）主要试剂：四唑氮盐（MTT），二甲亚砜（DMSO），胰蛋白酶，细胞培养基粉（RPMI1640）、TUNEL 试剂盒、流式细胞术试剂盒、注射用紫杉醇。（2）细胞株：人肺癌A549 细胞株，用含10%胎牛血清RPMI1640 培养液，分别加入终浓度为100U/mL 的青霉素和链霉素，37.0℃，5%的CO2培养箱内常规传代培养。（3）纳米级Fe3O4紫杉醇磁流体：采用化学共沉淀法制成胶体混悬液，混悬液中，磁性粒子最终浓度为20 mg/mL，样品粒径范围约为46 nm，紫杉醇在磁流体中的浓度为1.56μmoL/mL，磁饱和强度是360 GS。样品使用前均以超声波处理5 min，该操作确保Fe3O4颗粒分布更均匀。（4）实验动物：4～5 周龄BALB/C 雌性裸小鼠32 只，质量20～24 g，浙江省医学科学院动物实验中心提供并饲养，实验动物生产许可证SCXK（浙）2008-0035。饲养于浙江省实验动物中心实验动物屏障系统，空气洁净度万级，换气次数15 次/h，温度21～24℃，湿度75%～80%。实验动物使用许可证SYXK（浙）2008-0113。（5）主要仪器设备：①高频感应加热机：型号：SP-04AC 4KW，深圳市双平电源技术有限公司提供。频率为100～250 KHz，感应线圈，由4 匝直径为4 mm 的铜管平行绕成内径为3 cm，长为4 cm 的线圈，铜管内通循环水。②测温设备：光纤温度传感器（YF-200），西安永泰传感有限公司提供。③流式细胞仪：FACSCalibur 型，美国BD 公司产品。④透射电镜：JEM-1230 型透射电镜，日本JEOL 公司。

1.2 方法 （1）细胞实验：取对数生长的人肺癌细胞A549，将细胞调成1×105/mL 的浓度，设置对照组、磁流体热疗组、化疗组及磁热化疗组。对照组小鼠不予以处理，磁流体热疗组的细胞加入3 mL（2 mg）的磁流体的培养液，磁场中作用30 min，温度控制在30℃，将化疗组细胞悬液按分组C1、C2、C3 顺序加入纳米紫杉醇的培养液中，使终浓度分别为3.3 mg/mL、6.6 mg/mL、13.2 mg/mL，磁热化疗组按分组D1、D2、D3 顺序加入纳米紫杉醇磁流体的培养液中，使终浓度分别为3.3 mg/mL、6.6 mg/mL、13.2 mg/mL，交变磁场作用30 min，温度控制43℃。各组均在第0 h、12 h、24 h、48 h、72 h 取细胞，应用胰蛋白酶消化后形成单细胞悬液，倒置显微镜下用血细胞计数板采用盲法计数，绘制成生长曲线。比较四组的生长曲线，并用MTT 法观察人肺癌活细胞的光密度值（OD）及杀伤率（CI），流式细胞仪检测各组肺癌细胞的细胞周期及凋亡率；应用光学显微镜比较组间细胞形态差异。（2）动物实验：提取对数生长期的人肺癌A549 细胞，应用胰蛋白酶进行消化，经过稀释后，在小鼠背部皮下注射0.2 mL。待注射后的荷瘤小鼠肿瘤结节长至平均直径约5 mm 时，实验员将其随机分为对照组、磁流体热疗组、化疗组及磁热化疗组。对照组：不做任何治疗。磁流体热疗组：向裸鼠肺癌模型内部注射20 mg 的磁流体，24 h 后在交变磁场下热疗，通过调节磁场强度将温度控制在43℃，热疗30 min。紫杉醇化疗组：向小鼠肿瘤内部注射2 mg 紫杉醇。磁热化疗组：向肿瘤内部注射纳米紫杉醇磁流体20 mg，24 h后在交变磁场下热疗，通过调节磁场强度将温度控制在43℃，热化疗30 min。观察四组荷瘤小鼠的一般情况，比较治疗前后瘤体重量变化，在不同时间点使用游标卡尺测量肿瘤结节的长径（a）、短径（b），按公式V=ab2/2，估算肿瘤近似体积，根据每日测得的肿瘤体积绘制生长曲线。此外，借助光学显微镜观察各组肿瘤细胞内部变化，从而比较各个组间的疗效差异。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件分析，计量资料用（±s）表示，多组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD 检验；计数资料用%表示，用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米紫杉醇磁流体一般参数 磁性粒子的终浓度为20 mg/mL 左右。用激光散射测得粒子粒径（DLS）约在46 nm 左右，TEM 图中粒径为10 nm 左右，内核磁性纳米颗粒的直径为10 nm。使用VSM 的仪器测试饱和磁化强度，包覆前的磁性粒子饱和磁化强度为70 emu/g，包覆后为39 emu/g。紫杉醇在磁流体中的浓度为1.56μmol/mL（见图1～2）。

图1 粒径约46 nm左右纳米紫杉醇磁流体

图2 纳米紫杉醇的饱和磁化强度

2.2 人肺癌细胞A549 的生长曲线 随着时间延长，对照组和磁流体热疗组肺癌细胞增加明显，磁流体热疗组比对照组细胞生长仅轻度受到抑制；化疗组（C1，C2，C3）、磁热化疗组（D1，D2，D3）人肺癌细胞增长均受到明显抑制，其抑制效果与紫杉醇浓度的增加明显相关（见图3）。

图3 各组人肺癌细胞A549生长曲线比较

2.3 各组人肺癌细胞A549 的OD 及CI 化疗组和磁热化疗组，随着药物浓度的增加，OD 值随之减小，CI 值增大，在同等药物浓度下，热化疗组中肺癌细胞的OD值和CI 值均与其他各组差异有统计学意义（P＞0.05）见表1。

表1 各组人肺癌细胞A549的OD及CI比较

2.4 流式细胞仪检测人肺癌细胞A549 的凋亡率及细胞周期 流式细胞仪检测人肺癌细胞A549 的凋亡率显示，磁热化疗组凋亡率均高于其他组，且与紫杉醇浓度呈现剂量-反应关系（见图4）。细胞周期结果显示，与对照组比较，在化疗组中，人肺癌细胞A549 细胞在G2/M 期（合成后期/分裂期）增加；在磁流体热疗组和磁热化疗组，A549 细胞在S 期（合成期）明显增加（P＜0.05）（见图5）。

图4 各组人肺癌细胞凋亡率

图5 各组人肺癌细胞周期图

2.5 光镜和电子显微镜观察细胞形态 在光学显微镜下可见对照组内细胞大小未见明显变化，细胞数量多、贴壁良好。磁流体热疗组细胞开始出现减少，开始出现坏死细胞；化疗组（C1、C2、C3 组）随着紫杉醇浓度的升高，其正常细胞逐渐减少、坏死细胞及细胞碎片逐渐增多、细胞贴壁逐渐减少甚至出现无贴壁现象；磁热化疗组（D1、D2、D3 组）细胞破碎现象更突出，在D3 组甚至只见材料而无细胞（见图6）。电镜下观察发现，化疗组和磁热化疗组细胞染色质浓集、胞浆空泡化、细胞核裂解；随着温度的升高，细胞核呈现溶解，正常细胞结构消失，呈坏死表现（见图7）。

图6 光镜观察各组人肺癌细胞图像

图7 磁热化疗后肺癌细胞电镜图像

2.6 小鼠接种肿瘤的一般情况 将24 只裸鼠接种肿瘤，成瘤率100%，成瘤时间为细胞种植后第4～13 天，主要集中在第8～10 天。肿瘤细胞种植后第21 天，肿瘤直径平均达6 mm。成瘤后早期裸鼠的体质量和活动情况无明显改变，肿瘤有效种植后逐渐增大，与此同时裸鼠逐渐出现精神疲软、消瘦、活动量减少等现象。

2.7 磁流体在肿瘤内部升温情况 实验过程顺利，瘤体内部的温度迅速升高至43.0℃，通过控制磁场强度将温度稳定在43.0℃左右，并维持30 min，而小鼠肛门的温度则稳定在32.0℃左右。见图8。

图8 瘤体内部和小鼠肛门温度变化

2.8 组织学变化 （1）大体观察：治疗后，对照组肿瘤呈进行性增长，呈椭圆形，体积随时间增长，且表面无异常；磁流体热疗组大部分瘤体表面破溃后结痂，2～3 d 后出现局部坏死，坏死脱落后表面溃烂，肿瘤生长缓慢；化疗组肿瘤表面无明显变化，生长明显减慢；磁热化疗组瘤体生长基本停滞，且肿瘤表面较磁流体热疗组破溃面积大，并出现表浅溃疡，愈合结痂时间延长。（2）光镜观察：对照组瘤体生长旺盛，细胞核浓染，偶而可见核分裂象，肿瘤中心部位可见少量坏死的组织。磁流体热疗组、化疗组以及磁热化疗组的瘤体出现大量呈凋亡形态的肿瘤细胞，表现为细胞核缩小、发生凝聚，染色质边聚；部分区域出现凝固性坏死的征象，表现为嗜酸性增强，失去正常细胞结构，出现核碎裂、核溶解等坏死样表现；同时在一些区域偶可见出血灶。光镜下可见磁流体主要积聚于凋亡和坏死的区域中。细胞大量凋亡坏死的现象在热化疗组中最明显。散在的磁流体在一定范围内分布于肿瘤细胞之间（见图9）。

图9 各组瘤体病理学变化（HE×100）

2.9 各组小鼠治疗效果 治疗后2 周，与对照组比较，化疗组和磁热化疗组体积变化差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组比较，化疗组和磁热化疗组瘤体重量差异有统计学意义（P＜0.05）。表2。

表2 热疗后2周各组小鼠瘤体体积和质量

3 讨论

20 世纪70 年代以来，较多的临床前研究已经证实热疗相关作用，其机制包括直接细胞毒作用、热诱导肿瘤微环境的改变、热与辐射和药物的协同作用等［8］，其中和药物的协同作用也已在多种癌症相关的临床研究中得到证实，较为典型的有异环磷酰胺联合热疗治疗晚期软组织肉瘤［9］、热灌注加用美法仑治疗黑色素瘤［10］等，多种热疗的形式联合化疗药物在临床上有较好的应用。

本研究结果显示，在细胞实验中，磁流体热疗组、化疗组、磁热化疗组细胞生长曲线及凋亡率与对照组比较差异有统计学意义，表现为明显的抑制，其中磁热化疗组的抑制作用最明显，且随着紫杉醇的增加，其联合抑制作用更明显。在小鼠实验中，测量肿瘤内部温度和肛门温度，发现磁流体加热过程中，两者温度差异有统计学意义，可见磁流体热疗可以实现局部加热，而周围未注射磁流体的区域升温不明显，本实验通过测量肿瘤体积及质量以及光镜下组织学改变，进一步证实磁流体热化疗对肿瘤生长较强的抑制作用。

磁流体热化疗可能存在多种机制，作者认为，升温可以增加化疗药物的细胞毒性作用，同时也可以增加肿瘤部位的局部血流，增加肿瘤对化疗药物的摄取，升温甚至可能使某些DNA 聚合酶降低活性或失去活性，可以更好抑制肿瘤细胞的修复作用［11］。

综上所述，磁流体热化疗是应用磁流体热疗与化疗药物的联合，这种技术不仅能局部靶向加热肿瘤，同时借助磁流体更好的靶向运输化疗药物，比传统意义上的热化疗（如热灌注化疗等）有了一定的进步。磁流体热化疗杀伤肿瘤细胞有较大的价值，但离真正应用于临床尚有一定的距离，如磁流体的剂量、浓度及国际标准问题，磁流体热化疗对于人体安全性的问题，实现人体磁流体热化疗的具体措施问题还需要更多的研究。