婴幼儿配方乳粉中核苷酸含量检测条件优化研究

谢继辉

（安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051）

核苷酸是由含氮杂环碱基、五碳糖和磷酸基团组成的一类化合物。生物的遗传信息存储于DNA和RNA中，而核苷酸是DNA和RNA的合成前体。此外，核苷酸还具有代谢调节、组成辅酶、参与糖原和糖蛋白的合成过程。遗传信息传递成功，对人类生命活动极其重要。研究表明，喂养强化核苷酸配方奶粉的婴幼儿在体重、身长、头围、肠道耐受性等指标上，与母乳喂养的婴幼儿数据更为接近。另有研究显示核苷酸还具有降低腹泻的风险和发生率、提高免疫力、改善肠道微生态、改善婴儿血脂组成、增强婴幼儿对疫苗的反应等功能。

由于核苷酸可在人体内合成，对于成年人来说无需专门补充核苷酸。但婴幼儿身体生长速度快，身体合成机能发育还不完善，故其体内核苷酸的合成速度不能满足其生长的需求。目前，婴幼儿配方奶粉多以牛乳、羊乳为原料制成。牛乳和羊乳中核苷酸的浓度和种类与人类母乳有明显差异。母乳是婴儿的最佳食物，含有较高浓度的核苷酸，为使婴幼儿配方奶粉尽可能地接近母乳，需要在其中额外添加核苷酸。自1965年起，日本、欧盟、美国先后允许将核苷酸添加在婴幼儿配方食品当中。《食品安全国家标准 食品营养强化剂使用标准》（GB 14880——2012）[1]规定，核苷酸作为营养强化剂，可被用于婴幼儿配方食品，含量范围为0.12～0.58 g·kg-1（以核苷酸总量计）。婴幼儿乳粉中通常使用的核苷酸有5种，分别是胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）和腺嘌呤核苷酸（AMP）。目前在中国的市场上，半数以上的婴幼儿配方奶粉的产品的营养成分表上都标示添加了核苷酸。

由于婴幼儿配方奶粉的质量关乎下一代的健康成长，我国市场监管部门在每年的食品抽检中对其非常重视，所抽检的样品要按照抽样细则指定方法按营养成分表逐项检验。文献报道的核苷酸检测方法有离子色谱法[2]、毛细管电泳法、液相色谱法[3-5]、液相色谱-质谱法[6]等，但在近年的食品抽检中，婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量的测定指定的检验方法是《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》（GB 5413.40——2016）[7-9]。该方法的原理是用水提取样品，调节pH值沉淀蛋白质后，借助高效液相色谱仪检测。然而，在实际的检测过程中，往往发现用该方法得出的数据远高于实际值，其原因是色谱分析中有杂质没有被完全分离，导致检出值偏高。故本研究主要考察影响分离效果的主要因素，以优化此方法，使得检验数据更准确。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP），上海安谱；质控样品：QCIP-714婴儿配方乳粉中核苷酸定量分析质控样品，中国检验检疫科学研究院；冰乙酸、磷酸氢二钾，国药；四丁基硫酸氢铵，MACKLIN。

高效液相色谱仪，岛津LC-20AD，配二极管阵列检测器SPD-M20A，工作站软件LabSolutions；纯水机，ELGA GLXXXDIM2；电子天平，METTLER TOLEDO XSE204；pH计，METTLER TOLEDO S220。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

①标准溶液配制。核苷酸标准品CMP、AMP、UMP各称取10 mg，GMP和IMP各称取5 mg，用纯水溶解后转移至100 mL容量瓶中，用水定容。此标准溶液浓度为CMP、AMP、UMP各100 μg·mL-1；GMP、IMP各50 μg·mL-1。分别吸取此混合溶液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL和10 mL，加超纯水定容至50 mL，此为核苷酸系列标准工作液。②磷酸盐缓冲液。称取1.36 g磷酸二氢钾，0.475 3 g四丁基硫酸氢铵，加入接近1 L的纯水溶解，用磷酸氢二钾溶液精细调节pH值至3.2，用水定容到1 000 mL。

1.2.2 样品处理

称取奶粉试样5 g于锥形瓶中，加入20 mL温水（50～60 ℃）充分溶解，冷却至室温后用醋酸溶液调试样溶液至pH=4.1，移入50 mL容量瓶中，定容，滤纸过滤，所得滤液用0.45 μm滤膜过滤备用。

1.2.3 单因素试验设计

（1）改变流动相中有机相比例对分离效果的影响。取样品乳粉按1.2.2处理后，使用液相色谱检测，色谱条件依照1.2.4设置，使用安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相pH值按照《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》（GB 5413.40——2016）规定调节至pH=3.20左右。仅改变流动相中甲醇含量，分别以甲醇1%、3%、7%和10%的不同比例进行检测。通过工作站软件LabSolutions计算目标峰分离度。

（2）流动相pH值对分离效果的影响。样品乳粉按1.2.2处理后，使用液相色谱检测，色谱条件依照1.2.4设置，仅改变流动相中磷酸盐缓冲液的pH值。按照标准规定配制磷酸盐缓冲液，之后用磷酸和磷酸氢二钾调节pH值至2.9、3.0、3.1、3.2和3.3左右。流动相中甲醇设置为4%。更换流动相后充分平衡后再进样。

（3）不同色谱柱分离效果研究。样品乳粉按1.2.2处理后，分别使用不同型号色谱柱，并调节流动相pH值至2.9、3.0、3.1、3.2、3.3左右进行检测分析。寻找最佳分离条件。

1.2.4 色谱条件

流动相水相：磷酸盐缓冲液；流动相有机相：甲醇；流速：1 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；进样体积：10 μL。

2 结果与分析

2.1 改变流动相中甲醇含量对分离效果的影响分析

一般来说，目标峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5，被认为分离效果较好。本实验中，使用安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，流动相pH值调节至3.241的情况下，UMP与GMP的分离效果不佳，即GMP的分离度明显小于1.5。且改变流动相中甲醇比例后，目标峰和杂质峰出峰时间变化基本同步，不能提高分离效果，见表1。

表1 流动相中不同甲醇含量下目标峰分离度

2.2 流动相pH值对分离效果的影响分析

由图1可知，当流动相pH=3.126时，AMP与杂质峰融合，不能分离，导致AMP检出值偏高。图2为流动相pH=3.011时图谱，可见AMP出峰时间提前，与杂质峰分离。但GMP与IMP之间有一杂质峰，对比图1与图2可发现，如pH值更低，该杂质峰将与IMP融合，导致IMP检出值偏高。反之，如pH值增加，该杂质峰可能与GMP融合，也会导致检出值偏高。其原因是当pH值较高时，各核苷酸出峰时间均会延后，但延后程度各不相同，其中腺嘌呤核苷酸（AMP）出峰时间变化其他核苷酸更为明显。利用这种规律可找到各核苷酸能够正好分离的流动相pH条件。

图1 流动相pH=3.126时色谱图

图2 流动相pH=3.011时色谱图

表2为使用安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，在不同流动相pH值下的质控样品回收率，此结果显示最佳pH条件在3.0左右，而且pH值仅仅改变0.1都可能对结果产生较大影响。实验中也发现，因流动相pH值对实验结果影响很大，所以检验前平衡色谱柱需要花费很长时间。且流动相在配制时需要特别注意，要待试剂溶解充分后再调节pH值。进样时要注意仪器的使用环境，避免昼夜温差过大使流动相pH值产生变化。

表2 不同pH值流动相下质控样品回收率

2.3 色谱柱对分离效果的分析

使用不同色谱柱，在不同pH值流动相条件下对同一样品的分析结果显示，不同色谱柱的分离效果有明显不同，不同色谱柱对应的流动相最佳pH值也不同。每种色谱柱表现最好的pH值和对应回收率见表3。从结果看，一般常用色谱柱，如果找到合适的pH值（多在3.0左右），都可以把回收率控制在110%以内，可以认为满足正常检验需求。但不同色谱柱对本实验中流动相条件（低pH值、高水相、含表面活性剂）的耐受性不同，实验中发现有些色谱柱表现不稳定，运行时间稍长即出现出峰时间变化，分离度降低等现象。

表3 不同色谱柱的最佳pH值和回收率

3 结论与讨论

从实验结果看，婴幼儿配方奶粉中核苷酸的分离中最大的影响因素是流动相的pH值、其次是色谱柱的选择以及两者的匹配。《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》（GB 5413.40——2016）标准中推荐的流动相pH=3.20略高，检测时可以根据本实验具体条件调低一些。同理，也可以把pH值调高，pH值调高后，AMP出峰时间相比其他4个核苷酸延后更明显，也可以达到分离效果。但此条件下核苷酸出峰时间延后，色谱时间太长。通常为缩短色谱时间，可采用梯度洗脱，但核苷酸对色谱条件极为敏感，即使采用梯度洗脱，还是需要一个相当长的平衡时间，否则重现性不好。故综合看来，低pH值分离最为合适。建议在首次开展检测时，对选定的色谱柱，从pH=2.9～3.0开始摸索最适合的色谱条件。

本方法中流动相含离子对试剂，流动相pH值比较低，有机相含量也很低，这种条件对色谱柱伤害较大，使用几次后，色谱柱柱效就会明显下降，这也是分离效果差的一个常见原因。