基于网络药理学探讨蛇床子-补骨脂治疗乳腺癌骨转移的作用机制

柯昌虎, 严 慧, 陈琴华, 黄慧敏, 昝继斌, 何晓东

乳腺癌是危害全球女性健康的最常见癌症,骨转移是疾病复发的最常见部位,约75%的晚期乳腺癌患者会发生骨转移。目前,乳腺癌骨转移被认为是难以治愈的,患者的5年生存率仅为20%～30%[1]。临床上,乳腺癌骨转移继发的并发症包括疼痛、病理性骨折、脊髓压迫、恶性高钙血症等,对患者的生存预后及生活质量产生负面影响,对个人和社会造成重大的经济负担[2]。乳腺癌骨转移常用的治疗方法包括抗肿瘤全身疗法、骨靶向药物等,目的在于减缓骨吸收,降低骨骼相关事件的风险[3],但骨转移瘤最终会对治疗产生耐药性,疾病也随之发展。近年来,中医药治疗乳腺癌骨转移取得了显著的效果且在临床中的应用也越来越广泛[4-5]。乳腺癌骨转移属于中医学“骨痹”“骨瘤”范畴。《黄帝内经·素问》:“肾主骨,生髓”“肾其充在骨”[6]。《医经精义》:“肾藏精,精生髓,髓生骨,故骨者肾之所合也”[7]。由此可见,乳腺癌骨转移的发生与肾密切相关。《素问·逆调论》:“肾不生则髓不能满,故寒甚至骨也”[6]。《外台秘要》:“若劳伤肾水,不能荣骨而为肿瘤”[8]。强调骨转移的病因由“肾衰”所起,为肾气亏损、阴阳失调所致,故温补肾阳是逆转病机的关键。蛇床子味辛、苦,性温,归肾经,具有温肾壮阳之功。补骨脂味辛、苦,性温,归肾、脾经,具有温肾助阳之功。蛇床子-补骨脂是温肾的常用药对,源自《太平圣惠方》卷九十八“补骨脂丸”,共济补肾养阳、强力健肌之效。在临床应用中,顾氏外科以扶正先安未受邪之地,临证习用中药蛇床子、补骨脂、附子、淫羊藿、杜仲、狗脊温肾助阳生髓,治疗乳腺癌骨转移患者[9]。刘胜教授认为乳腺癌骨转移当扶正祛邪,温肾壮骨,多用蛇床子、补骨脂、肉苁蓉等温而不燥、补肾生髓之品,以壮骨通阳[10]。现代药理研究表明,蛇床子-补骨脂能够减轻乳腺癌骨转移的程度,从多环节抑制骨转移骨质损伤,配伍引经药可以增强其下调裸鼠上肢骨转移灶中趋化因子配体12(chemokine ligand 12,CXCL12)、趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)的表达水平,对上肢骨转移产生治疗作用[11]。温肾壮骨方(蛇床子、补骨脂和制附子)可以通过转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)介导的Jagged1/Notch信号通路减轻乳腺癌骨转移[12];可以通过调节TGF-β1/Smads信号抑制骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)诱导的乳腺癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和骨转移[13]。尽管在临床上蛇床子-补骨脂作为药对常用于乳腺癌骨转移的治疗,但其治疗乳腺癌骨转移的物质基础及分子机制尚待明确。本研究通过构建蛇床子-补骨脂的有效成分-乳腺癌骨转移靶点网络,利用网络药理学方法探讨其可能治疗乳腺癌骨转移的作用机制。

1 资料与方法

1.1蛇床子-补骨脂活性成分及作用靶点的筛选 以“蛇床子”为检索词,检索中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP;https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug-likeness,DL)≥0.18两项控制指标筛选蛇床子成分[14],并检索文献[15-16]补充活性成分。以“补骨脂”为检索词,检索中药分子机制的生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine,BATMAN-TCM;http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/),以Score cutoff=20和P<0.05两个指标作为筛选条件获取补骨脂候选成分。将两个药物的成分进行合并去重,在有机小分子生物活性数据库(PubChem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找成分的SMILES格式,并导入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)获取靶点,选取Probability>0的靶点。

1.2乳腺癌骨转移疾病相关靶点的筛选 以“乳腺癌骨转移”为检索词,在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)和在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)数据库(https://omim.org/)中筛选乳腺癌骨转移相关靶点,其中GeneCards根据Relevance score大小顺序筛选前500个靶点。

1.3活性成分-疾病共有靶点的筛选 在Venny 2.1在线平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)分别录入蛇床子-补骨脂与乳腺癌骨转移的靶点,绘制韦恩图,获取药物和疾病的共有靶点。

1.4药物-成分-靶点-疾病网络构建 使用Cytoscape 3.8.2软件,构建“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络,使用Network Analyzer功能以节点自由度(degree)为指标进行分析。

1.5蛋白相互作用网络的构建 将共有靶点上传至STRING数据库(https://www.string-db.org/),设置交互作用score>0.4的靶点,并将TSV文件导入Cytoscape 3.8.2软件绘制蛋白相互作用网络。

1.6GO功能分析和KEGG通路富集分析 在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO功能分析与KEGG通路富集分析,以P<0.05为阈值,探讨蛇床子-补骨脂治疗乳腺癌骨转移的生物学过程和信号通路。

2 结果

2.1蛇床子-补骨脂主要活性成分及作用靶点的筛选结果 通过TCMSP共获得蛇床子的活性成分19个,并通过文献查阅补充1个活性成分:蛇床子素(osthol)。在BATMAN-TCM中共收集到补骨脂活性成分29个。取Swiss Target Prediction数据库中Probability>0的靶点,去重并剔除无靶点的成分,最终得到42个活性成分,对应618个作用靶点。其中豆甾醇(stigmasterol)为蛇床子和补骨脂的共有成分。

2.2疾病靶点的检索及活性成分-疾病共有靶点的筛选结果 使用GeneCards、OMIM数据库筛选乳腺癌骨转移的靶点。GeneCards中取前500个靶点,OMIM中获得169个靶点,合并去重后共获得654个靶点。使用Venny在线工具对蛇床子-补骨脂靶点和乳腺癌骨转移靶点进行分析,得到共有靶点99个。见图1。

图1 蛇床子-补骨脂和乳腺癌骨转移的靶点匹配韦恩图

2.3药物-成分-靶点-疾病网络构建 将共有靶点进行反相匹配,去除补骨脂香豆雌烷B(bavacoumestan B)和正三十烷(triacontane)2个无对应靶点的成分。将蛇床子-补骨脂其余40个活性成分与共有靶点信息输入Cytoscape 3.8.2软件中,绘制蛇床子-补骨脂“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图,见图2。对网络图进行拓扑分析,degree排名前12位的成分见表1,其可能是蛇床子-补骨脂治疗乳腺癌骨转移的关键活性成分。

表1 蛇床子-补骨脂的关键活性成分信息表(Top 12)

2.4蛋白相互作用网络构建 在STRING数据库中录入蛇床子-补骨脂和乳腺癌骨转移共有靶点,物种设定为“Homo sapiens”,选取置信度>0.4的网络数据,游离靶点2个,得到蛇床子-补骨脂治疗乳腺癌骨转移的靶点蛋白相互作用信息数据,导入Cytoscape 3.8.2中进行可视化分析,结果见图3。degree排名前10位的靶点见表2,其可能在乳腺癌骨转移治疗中具有重要的调控作用。

表2 蛇床子-补骨脂的关键作用靶点(Top 10)

网络中共有97个节点,1 645条边,degree平均值为33.9175,大于平均自由度值靶点的有44个

2.5GO功能分析结果 利用DAVID数据库进行GO功能分析,结果获得607条生物学过程,其中生物过程(biological process,BP)456条,主要涉及蛋白质自磷酸化、激酶活性的正调节、凋亡过程的负调控、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白质磷酸化等;细胞组分(cell component,CC)64条,主要涉及受体复合物、核质、细胞核、高分子复合物、质膜等;分子功能(molecular function,MF)87条,主要涉及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、相同蛋白结合等。分别选取BP、CC、MF的前10个条目进行气泡图展示,见图4。提示蛇床子-补骨脂通过调控多种生物学过程对乳腺癌骨转移产生作用。

其中横轴为富集因子,纵轴为GO功能名称

2.6KEGG通路富集分析结果 对筛选的基因进行KEGG通路富集分析,共获得147条信号通路,主要涉及癌症途径(54个靶点)、内分泌抵抗(25个靶点)、磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-serine/threonine protein kinase,PI3K-Akt)信号通路(35个靶点)、癌症中的蛋白聚糖(28个靶点)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(20个靶点)、癌症中的微小RNA(30个靶点)、癌症中的中心碳代谢(18个靶点)、催乳素信号通路(17个靶点)、细胞衰老(21个靶点)、细胞凋亡(20个靶点)、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products,AGE-RAGE)信号通路(18个靶点)、Ras信号通路(24个靶点)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路(26个靶点)、乳腺癌(20个靶点)等。选择前20条进行气泡图展示,见图5。提示蛇床子-补骨脂的作用靶点分布于不同的通路中,可通过多种通路达到治疗乳腺癌骨转移的作用。

其中横轴为富集因子,纵轴为通路名

3 讨论

3.1《黄帝内经》:“正气存内,邪不可干”[17]。《灵枢·海论》:“髓海有余,则轻劲多力,自过其度”[18]。肾充养骨骼,肾实则骨有生气,骨髓生化有源。《灵枢·经脉篇》:“足少阴气绝,则骨枯。少阴者,冬脉也。伏行而濡骨髓者也,故骨不濡”。肾虚而骨失养,百病丛生[18]。“邪之所凑,其气必虚”,损伤正气,耗竭肾精,无以充髓养骨,以致毒邪乘虚而入,凝结于骨而成骨转移[19]。乳腺癌骨转移病位在骨,其发生为骨之“正气不足”,病机多为本虚标实,选方用药常不离益肾。蛇床子和补骨脂均属于温肾中药,共奏补肾壮骨,是临床上广泛应用于乳腺癌及乳腺癌骨转移的治疗药物。相关研究表明,蛇床子活性成分蛇床子素可以通过调节细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡,以及乳腺癌骨转移过程中成骨细胞、破骨细胞和癌细胞的相互作用,显著减少小鼠的骨转移,并降低了乳腺癌转移的总肿瘤负担[20]。补骨脂可以通过线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡[21]。同时,蛇床子-补骨脂药对配伍常作为复方的组方要件,组方不同则产生不同的临床疗效。例如,乳腺术后骨转方具有温肾健脾、通络止痛的功效,主要用于乳腺癌骨痛的治疗;温肾壮骨方具有壮骨通阳的功效,主要用于乳腺癌骨转移的治疗。本研究基于网络药理学方法对蛇床子-补骨脂治疗乳腺癌骨转移的机制进行了分析探讨。

3.2通过TCMSP、BATMAN-TCM进行成分查找,笔者从蛇床子-补骨脂中筛选出香叶木素、异补骨脂二氢黄酮、补骨脂甲素、O-乙酰异蛇床素、补骨脂二氢黄酮甲醚、美花椒内酯、欧芹素、蛇床子素等活性成分。其中香叶木素为天然黄酮类化合物,可以通过活性氧(reactive oxygen species,ROS)及p53介导的线粒体凋亡途径抑制MCF-7细胞的增殖及促进其凋亡[22];亦可通过细胞周期阻滞和线粒体介导的内在凋亡途径对MDA-MB-231细胞产生抗增殖和促凋亡作用[23]。乳腺癌细胞分泌可溶性因子,加速破骨细胞分化,导致溶骨性骨转移的形成,香叶木素可以抑制破骨细胞分化和骨吸收功能,从而起到阻止脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的骨溶解模型小鼠骨量丢失的作用[24]。补骨脂甲素属于二氢黄酮类化合物,具有抑制乳腺癌细胞增殖的作用[25]。蛇床子素是天然香豆素类化合物,可以抑制乳腺癌细胞生长、迁移和侵袭,并诱导乳腺癌细胞凋亡,在体内外实验均显示其可通过下调整合素α3/整合素β5(integrin α3/integrin β5,ITGα3/ITGβ5)信号转导来抑制乳腺癌转移[15];也可通过诱导细胞周期阻滞、线粒体功能障碍和内质网应激抑制人乳腺癌细胞发生发展[26];还可以通过上调抑癌基因G蛋白质γ7(G protein gamma 7,GNG7)抑制乳腺癌进展[27]。

3.3经蛇床子-补骨脂和乳腺癌骨转移靶点交集筛选出EGFR、Akt1、SRC、STAT3、Jun、CCND1、CASP3、ESR1、ERBB2、TNF等共有靶点。其中,EGFR常在转移性乳腺癌中过度表达,苏氨酸654(threonine 654,T654)处EGFR磷酸化的增加与上皮间质、迁移和侵袭以及转移的增加相关[28]。EMT是促进癌细胞迁移、侵袭和转移的重要生理过程,Akt1可以通过降解磷酸化依赖性Twist1来抑制乳腺癌EMT[29]。在癌症的进程中,SRC可以与核受体及其他转录因子相互作用,促进多个基因的转录,从而增强癌细胞的增殖、迁移、侵袭、肿瘤血管生成和EMT[30]。CCND1位于11号染色体长臂11q13.3处,编码细胞周期蛋白D1蛋白,乳腺癌中CCND1拷贝数的增加与高组织病理学分级、高增殖和Luminal B亚型相关[31]。ESR1的激活突变可引起转移性肿瘤细胞的内分泌抵抗,ESR1突变与雌激素受体表达和高增殖活性有关,并影响约14%的乳腺癌雌激素受体阳性骨转移[32]。TNF-α在癌症的发展过程中具有两面性,高剂量诱导显著的抗癌作用,而生理和病理水平的TNF-α可能与癌症促进、肿瘤生长和转移有关,且TNF-α通过激活c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)/c-Jun信号通路诱导MCF-7乳腺癌细胞中干扰素诱导蛋白10(interferon-induced protein 10,IP-10)的表达[33]。

3.4经GO功能分析获取蛋白质自磷酸化、激酶活性的正调节、凋亡过程的负调控、肽基酪氨酸磷酸化、受体复合物、核质、细胞核、高分子复合物、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、ATP结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性等生物学过程。经KEGG通路富集分析获取癌症途径、内分泌抵抗、PI3K-Akt、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的微小RNA、癌症中的中心碳代谢、催乳素、Ras、MAPK等信号通路。其中PI3K-Akt-mTOR是一种参与细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、葡萄糖代谢和DNA修复的信号通路,与癌症和骨溶解的发展密切相关,抑制PI3K-Akt-mTOR信号通路可以抑制乳腺癌生长和乳腺癌诱导的破骨细胞形成[34]。在大鼠乳腺癌骨转移模型中,PI3K-Akt信号通路还参与了骨癌痛的中枢敏化,提示其在骨癌痛发生、发展中起着重要作用[35]。催乳素-催乳素受体可以显著影响乳腺癌骨转移,且催乳素受体还可以调节乳腺癌骨转移的肿瘤微环境,从而诱导溶解性破骨细胞的形成[36]。Ras通路参与细胞增殖和生长、细胞存活和凋亡、代谢和运动的信号分子活化,在MDA-MB-231细胞中敲减剪接因子3b亚基1(splicing factor 3b subunit 1,SF3B1),通过Ras、MAPK等信号通路抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡[37]。另外,RNA SLIT2增强子通过调节P38 MAPK/c-Fos信号通路抑制乳腺癌骨转移[38]。

综上所述,本研究应用网络药理学方法对蛇床子-补骨脂治疗乳腺癌骨转移的物质基础和分子机制进行探索,从分子水平对其作用机制进行系统分析,蛇床子-补骨脂中的香叶木素、蛇床子素等有效成分可以作用于EGFR、Akt1、SRC、STAT3、Jun等靶点,通过多途径治疗乳腺癌骨转移,从而为蛇床子-补骨脂的临床应用和机制研究提供了依据。