水杨酸钠增强氧化应激介导耳蜗螺旋神经节神经元损伤作用的实验观察

祝小婷, 黄佳琳, 林晓宇, 苏纪平

水杨酸是阿司匹林的活性成分,具有解热镇痛、抗炎等多种功效,是目前全球应用最广泛的非甾体类药物之一。然而,在水杨酸类药物使用过程中常伴随着不少的副作用,尤以耳毒性最为常见,主要表现为耳鸣和听力下降[1]。耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons,SGN)是连接毛细胞与听觉中枢的重要枢纽,已被证实是水杨酸钠(sodium salicylate,SS)耳毒性的重要作用位点[2],但其具体作用机制仍未完全明了。氧化应激是耳聋的常见损伤机制,在噪声性聋[3]、老年性聋[4]以及顺铂诱导的耳毒性聋[5]中均可观察到氧化应激增强。有研究显示SS对神经元的氧化应激损伤具有保护作用[6-7]。但亦有研究发现SS会增强氧化应激,诱导细胞凋亡[8]。本课题组既往研究发现,SS使SGN中过氧化物阴离子[活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)来源之一]水平升高[9],提示SS可能通过增强氧化应激导致SGN损伤。本研究旨在通过免疫荧光技术观察SS对新生SD大鼠耳蜗SGN的影响,定位ROS产生的位置并量化其表达水平,为进一步研究SS致SGN损伤的机制提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选取新生2～3 d龄无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级SD大鼠21只,雌雄不限,由广西医科大学实验动物中心提供。耳蜗器官培养组6只,SGN原代培养组15只。其中耳蜗器官培养组随机分为对照组和5 mM SS组,每组3只。SGN原代培养组随机分为对照组、5 mM SS组、5 mM SS+N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)组、阳性对照过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)组、H2O2+NAC组,每组3只。

1.2主要仪器及试剂 主要仪器:细胞恒温培养箱(ThermoFisher公司),倒置显微镜及荧光显微镜(奥林巴斯公司)。主要试剂:10×多聚赖氨酸和100×青链霉素混合液购自索莱宝公司;DMEM-F12(1∶1)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer solution,PBS)购自Gibco公司;SS、4%多聚甲醛、Tritonx-100、山羊血清、H2O2购自Sigma公司;NAC购自阿拉丁公司;鼠抗βⅢ-Tubulin购自Abcam公司;Alexa-8890S标记山羊抗鼠IgG荧光二抗购自美国CST公司;CCK8检测试剂购自东仁化学科技有限公司;活性氧检测试剂盒购自碧云天公司;贴壁得购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1 SGN原代培养及SS干预方法 SD大鼠经75%酒精消毒后断头处死,对半剪开头颅并剔除脑组织后放于4 ℃ PBS中,在解剖显微镜下分离出完整的耳蜗,剔除螺旋韧带和基底膜,留取完整的蜗轴(即SGN所在部位),将其用胰蛋白酶消化10 min,离心、重悬后种植在用多聚赖氨酸包被过的培养皿上,将种植好的细胞放在细胞恒温培养箱中进行培养。用含胎牛血清及青链霉素混合液的培养基培养24 h后进行半换液,继续培养24 h后进行药物干预。SS处理组用含5 mM SS的培养基进行培养,SS+NAC组用含100 μM NAC培养基预处理1 h后再用含5 mM SS和100 μM NAC的混合培养基进行培养,H2O2组用含300 μM H2O2培养基进行培养,H2O2+NAC组用含100 μM NAC培养基预处理1 h后再加用含300 μM H2O2和100 μM NAC的混合培养基进行培养。

1.3.2 耳蜗器官处理及培养 SD大鼠经75%酒精消毒后断头处死,对半剪开头颅并剔除脑组织后放于4 ℃ PBS中,在解剖显微镜下沿耳蜗纵轴剥开蜗壳,仔细分离螺旋韧带,将含有Corti器及SGN的中回组织取出,平铺在事先用贴壁得孵育过的培养皿上,用含胎牛血清及青链霉素混合液的培养基培养。

1.3.3 SGN中氧化应激水平检测 SGN加药处理后,移除培养基,用DMEM-F12无血清培养基洗涤1次。加入ROS荧光探针DCFH-DA,在37 ℃培养箱中避光孵育20 min,移除荧光探针,用DMEM-F12洗涤3次(5 min/次),加入4%多聚甲醛固定30 min,移除固定液,用PBS洗涤3次(15 min/次)。将培养物放入神经元标志βⅢ-Tubulin一抗溶液(含1% Tritonx-100+5%山羊血清)中,4 ℃孵育过夜。移除一抗溶液,用PBS洗涤3次(15 min/次),滴加Alexa-8890S标记山羊抗鼠IgG荧光二抗溶液(含1%Tritonx-100+5%山羊血清),室温避光孵育2 h。移除二抗溶液,用PBS洗涤3次(15 min/次)。滴加抗荧光淬灭剂,封片后在荧光显微镜下观察并拍照,使用Image J软件对荧光强度进行量化分析。

1.3.4 CCK8法检测SGN细胞存活率 取原代培养SGN细胞接种于96孔板中,加药处理48 h后移除药物溶液。各孔加入100 μl DMEM-F12培养基后再加入10 μl CCK8反应溶液,继续孵育3 h。在酶标仪下检测各孔450 nm波长处的吸光度(optical density,OD)值。实验同时设置空白组(加入等体积的DMEM-F12培养基及CCK8反应溶液,不含细胞)。每组设置4个复孔,重复4次实验。细胞存活率(%)=[(处理组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

2 结果

2.1SS与SGN氧化应激水平 对于耳蜗器官培养SGN对照组和5 mM SS组,采用神经元标志物βⅢ-Tubulin标记SGN,SGN胞体和轴突均可见明显的红色荧光;ROS荧光探针DCFH-DA呈现绿色荧光,与对照组相比,经5 mM SS干预48 h后ROS荧光在SGN处升高,而在其他位置荧光强度无明显变化。见图1。为进一步量化ROS荧光强度,在原代培养大鼠SGN中,与对照组相比,5 mM SS干预48 h后,ROS平均荧光强度升高(P<0.001),与H2O2组结果一致(P<0.000 1)。见图2。

注:ⓐⓑ为对照组；ⓒ为ⓐⓑ的融合图；ⓓⓔ为5 mM SS处理组；ⓕ为ⓓⓔ融合图

图2 ROS在原代细胞中的表达及量化(200×)比较图

2.2氧化应激水平与细胞存活率 用氧化应激抑制剂NAC处理后,与SS处理组对比,SGN氧化应激水平下降(P<0.01)。CCK8实验显示,SS处理SGN 48 h后细胞存活率较对照组降低了41.34%(P<0.01)。在加入NAC之后,细胞存活率较SS组上升36.05%(P<0.01),与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。H2O2组处理SGN 48 h后细胞存活率较对照组下降52.31%(P<0.001),在加入NAC之后,SGN氧化应激水平下降(P<0.0001),细胞存活率较H2O2组上升34.73%(P<0.01)。见图3。

图3 SGN在不同处理组中的细胞存活率比较图

3 讨论

3.1药物性耳聋(drug-induced hearing loss,DIHL)是最常见的后天性感音神经性聋。SS作为全球用量最大的非处方药物阿司匹林的有效成分,可以高效、快速、稳定、可逆地诱导实验动物耳鸣甚至双侧对称的以高频为主的轻度至中度聋,因此是研究DIHL的良好工具药物。SGN是听觉神经通路的初级神经元,噪声、衰老、药物等各种原因造成的感音神经性聋,最终都造成SGN的不可逆损伤。本研究表明5 mM SS处理原代培养SGN 48 h后,细胞存活率下降。由于SGN缺乏再生能力,SGN的变性和丧失将导致不可逆感音神经性聋。因此,探索SGN损伤的深层机制,对治疗DIHL以及其他神经性耳聋具有重要意义。

3.2SS致神经元的损伤与兴奋毒性有关。研究发现,SS显著增加小脑旁绒球的谷氨酸水平,使其兴奋性中间神经元自发放电率显著增加[10]。在听觉系统中,SS能上调耳蜗背侧核[11]、下丘以及听皮层[12]NMDA受体表达。本课题组的前期研究也证实,SS易化SGN的NMDA受体的电流[13],上调SGN的NMDA受体表达[14],促进GABAA受体内化[15],可逆地抑制GABAA受体电流[16],使兴奋与抑制的平衡失调。这一系列的研究结果证实了SS可通过兴奋毒性介导SGN损伤。

3.3SS致神经元损伤的发生发展与氧化应激、凋亡密切相关。ROS通过引起细胞内酶活性改变、蛋白质变性、细胞膜结构、功能破坏等最终导致神经元变性或坏死[17]。本研究发现SS处理耳蜗器官48 h后,ROS在SGN上显著升高,而在支持细胞、成纤维细胞等其他细胞中无明显变化,提示SS选择性增强SGN的氧化应激水平。应用氧化应激抑制剂NAC可显著降低SGN的氧化应激水平,使细胞存活率上升,与阳性对照结果一致,提示SS通过增强氧化应激造成SGN死亡。本课题组此前的研究也发现在体外培养的大鼠耳蜗器官中,SS作用48 h后导致SGN发生神经纤维水泡化和断裂,核固缩和核碎裂等凋亡形态学改变,并且具有SS浓度及处理时间依赖性。然而,毛细胞及支持细胞即使在SS高浓度(10 mM)和长时间(96 h)的处理下,仍然没有明显的形态学损伤表现。SS处理后,只有SGN中的过氧化物阴离子增加,这提示SS可能选择性地导致SGN产生氧化应激损伤[9]。Abd-Elhakim等[18]研究发现在大鼠大脑皮层和海马组织中,SS提高了丙二醛和caspase-3水平,但总抗氧化能力和B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)水平降低,神经元变性坏死。另外,SS使人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y内的ROS水平增加,caspase-3表达增加,导致SH-SY5Y细胞凋亡[8]。其他的非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drug,NSAID)如双氯芬酸作用SH-SY5Y后,使ROS水平升高,caspase-3、caspase-8、bax、细胞色素c和p53表达水平升高,抗凋亡Bcl-2水平降低,引起氧化应激和细胞凋亡[19]。不仅在神经元中,SS亦造成其他细胞的氧化应激和凋亡。研究发现SS可以通过激活Rac1-NAPDH氧化酶依赖途径使ROS增加,进而造成线粒体膜电位下降,caspase激活,导致胃癌细胞凋亡[20]。在PEL原发性渗出性淋巴瘤细胞和C6胶质细胞中,SS均导致ROS大量生成,最终造成细胞凋亡[21-22]。这一系列的研究结果表明,SS通过氧化应激介导SGN损伤。

3.4在神经元中,胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)升高能够增强氧化应激。在分离的线粒体中发现,高浓度的Ca2+通过开放线粒体通透性转换孔增加ROS的生成[23]。而在氟化钠诱导的SH-SY5Y细胞毒性损伤中发现,[Ca2+]i升高伴随ROS增加,Ca2+螯合剂可以抑制ROS生成,但抗氧化剂不能抑制[Ca2+]i上调,表明[Ca2+]i上调是氧化应激的上游介导因素[24]。SS能升高神经元的[Ca2+]i。小鼠被注射SS后,大脑神经元中钙相关的活动增强[25]。SS也增强耳蜗背侧核神经元的钙内流[26]。本课题组的前期研究证实了SS易化NMDA受体电流(一种配体门控钙内流)[13],其他学者也证实了阿司匹林选择性增强SGN中NMDA诱导的电流[27]。当NMDA受体被过度激活时,[Ca2+]i会急剧上升,并引起兴奋毒性[28]。上述结果提示,SS通过易化SGN的NMDA受体,升高[Ca2+]i,并可能由此增强SGN的氧化应激,进而介导SGN损伤。

综上所述,SS通过增强SGN的氧化应激引起SGN的损伤,使用氧化应激抑制剂能够降低SGN的氧化应激,并且对SS致SGN损伤具有保护作用。关于氧化应激引起SGN损伤的具体机制仍需要进一步研究。