中国人群MYO15A基因同义突变引起剪接异常导致的非综合征型耳聋分析

王思霁, 郭亿莲, 钟鸣骏, 耿 佳, 彭 婉, 袁德健, 严提珍, 卢 宇

耳聋是最常见的感觉系统缺陷疾病之一,受遗传、慢性感染、长期声暴露、耳毒性药物和衰老等多方面因素影响,其中遗传因素是早发性耳聋的主要致病原因,约占60%[1-2]。据世界卫生组织报告,全世界有近5亿人需要听力康复,到2050年,将有超过7亿人,即十分之一人口发生听力损失。听力损失的预防、识别和康复为家庭和社会带来了沉重的经济和精神负担[3]。随着高通量DNA测序技术在遗传性耳聋领域的不断发展和普及,大规模平行测序(massively parallel sequencing,MPS)和全外显子组测序(whole exome sequencing,WES)使得40%～50%的遗传性耳聋患者能够明确基因诊断,对于未找到遗传病因的部分患者在常染色体隐性遗传相关基因中有时仅能检测到单杂合致病性突变或者致病性无法确定的同义或错义突变[4]。同义突变以往常常被认为是无临床意义的核苷酸替换,尤其是人群频率较高的同义突变在突变过滤时通常会被过滤掉。MYO15A基因是最常见的常染色体隐性非综合征型耳聋(autosomal recessive non-syndromic hearing loss,ARNSHL)致病基因之一,迄今为止,该基因已鉴定出超过200个突变与耳聋相关[5]。MYO15A基因所编码的肌球蛋白XVa对维持耳蜗毛细胞内肌球蛋白组织结构及毛细胞静纤毛的长度至关重要,其功能的丧失主要导致先天性双侧重度或极重度感音神经性耳聋,部分位于N-端区域的突变可导致有残余听力的轻中度感音神经性耳聋[6-8]。本研究通过MPS技术,在一个遗传性非综合征型耳聋家系中鉴定出MYO15A:NM_016239.4:c.8182C>G(p.Arg2728Gly)/c.9861C>T(p.Gly3287=)复合杂合突变。同时总结了在中国大型耳聋队列数据库中,c.9861C>T(p.Gly3287=)同义突变的基因型-表型特征以及在中国广西壮族人群中的等位基因频率。

1 资料与方法

1.1家系资料采集 该家系由华西医院罕见病研究院团队采集自广东省中山市,研究获医院伦理委员会批准[2021年审(190)号],家系编号HL-001631。参与研究的家系所有成员签署知情同意书。对家系成员进行问卷调查、听力学检查、体格检査等,并采集外周血5 ml,提取DNA,-80 ℃冻存待检。

1.2高通量测序和数据分析

1.2.1 测序及突变位点致病性分析 使用课题组自主研发的目标区域捕获试剂盒HHL-785进行检测,该试剂盒覆盖目前已知耳聋致病基因及听觉相关的基因共计785个。目标区域涵盖了785个基因的外显子、外显子上下游50 bp及线粒体DNA序列。以GRCh37/hg19为参考序列,测序下机原始序列数据应用BWA软件进行比对和定位,以Picard工具进行质控和去重操作,使用GATK和VEP工具进行突变识别和注释,次要等位基因频率(minor allele frequency,MAF)按<0.5%进行过滤,结合先证者及其家系成员的临床表型和遗传方式筛查候选突变,针对可疑突变位点检索遗传突变-临床表型相关数据库[ClinVar、DVD、人类基因突变数据库(HGMD)]获取更详尽的位点致病信息。最后,参考美国医学遗传学与基因组学学会和分子病理学协会(American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology,ACMG/AMP)遗传突变分类标准与指南对突变位点进行致病性判读[9]。

1.2.2 本研究同义突变在中国耳聋和对照人群检出情况 中国耳聋基因研究战略联盟(Chinese Deafness Genetics Consortium,CDGC)数据库是目前国内最大的耳聋专病队列和基因组数据库,已收集涵盖全国31个省(自治区、直辖市)41个民族的20 000余例耳聋病例,并有7 000余例听力正常的对照人群。总结该队列中MYO15A:NM_016239.4:c.9861C>T(p.Gly3287=)鉴定为致病突变的耳聋患者的基因型-表型,并统计该位点在人群中的携带率。

2 结果

2.1HL-001631家系资料及听力学特征分析结果HL-001631家系遗传图谱(见图1ⓐ)符合常染色体隐性遗传模式,早发性耳聋患者4例,参与本研究的家系成员2例(Ⅱ-1、Ⅱ-3),其中先证者(Ⅱ-1)为61岁中年男性,其二弟(Ⅱ-3)47岁。2例患者均为非进展性语前聋,中山市中医院纯音测听提示双侧极重度感音神经性耳聋(见图1ⓑⓒ),其他系统未见明显异常,无长期噪声暴露史及耳毒性药物用药史。先证者母亲(Ⅰ-2)自述在75岁左右出现进行性听力下降,检测时已85岁,纯音测听表现为高频下降明显的重度-极重度听力损失,考虑为老年性聋可能(见图1ⓓ)。

图1 HL-001631家系图及纯音听阈图

2.2致病基因鉴定结果 对病例Ⅱ-1和Ⅱ-3进行高通量测序分析,下机数据通过质控和去重后,使用GATK和VEP进行突变识别和注释。以MAF值<0.5%进行突变位点过滤,同时过滤掉ClinVar数据库中良性和可能良性的突变。根据家系耳聋遗传模式、听力表型、VEP Impact注释等条件对剩余位点进行筛查,同时在ClinVar、DVD、HGMD等突变注释数据库中核查可疑候选基因突变。在已知耳聋基因MYO15A中检出NM_016239.4:c.8182C>G(p.Arg2728Gly)/c.9861C>T(p.Gly3287=)复合杂合突变(见图2),2个突变均为已报道的致病性突变。错义突变p.Arg2728Gly于2019年在中国台湾非综合征型耳聋家系中被首次鉴定[10]。同义突变p.Gly3287=首次报道于美国的12个非综合征型耳聋家系,在21例耳聋患者中检出该致病同义突变,其中有20例为复合杂合突变,仅1例为纯合突变[11]。gnomAD数据库资料显示,该突变在德系犹太人人群中频率为0.4%(42/10 362),在东亚人群中频率为0(0/19 536)。

黑色代表患者中检出纯合突变,蓝色代表患者中检出复合杂合突变,紫色代表患者中既有纯合又有复合杂合突变,红色五星代表与轻-中度听觉表型相关突变

2.3MYO15A:NM_016239.4:c.9861C>T(p.Gly3287=)在CDGC数据库耳聋及人群队列中的致聋和携带情况 在CDGC耳聋队列数据库中,鉴定出MYO15A:NM_016239.4:c.9861C>T(p.Gly3287=)为耳聋致病突变的患者共5例,均为复合杂合致病。耳聋发病及确诊在儿童时期,表现为重度-极重度感音神经性听力损失。2例患者民族不详,2例为壮族,1例为回族。见表1。在CDGC人群队列中,检出3例听力正常者携带此突变,均为广西壮族人,该致病突变位点在广西壮族人群中MAF为0.2%(3/1 438)。

表1 CDGC数据库中MYO15A c.9861C>T致耳聋患者的基因型-表型情况

3 讨论

3.1本研究通过一个中国遗传性非综合征型耳聋家系鉴定出MYO15A基因的高频同义突变致病。该突变首次报道于2021年,为预防犹太遗传病委员会、费城儿童医院(Children′s Hospital of Philadelphia,CHOP)、爱荷华大学耳鼻喉科及肾脏分子研究中心(Molecular Otolaryngology and Renal Research Laboratories,MORL)等5个国际前沿遗传和分子研究中心,通过多中心合作和数据共享成功鉴定为致病性突变[11]。该研究最初在预防犹太遗传病委员会未明确遗传病因的德系犹太人耳聋家系中,部分家系均检出MYO15A基因的1个致病或可能致病的单杂合突变,尚不能解释耳聋家系的致病原因。随着多中心数据的共享和研究的深入,发现先前在生物信息学分析中,误将MYO15A的高频同义突变过滤掉,通过多中心数据整合、共分离分析和minigene功能验证,证实了该同义突变的致病性。该同义突变在德系犹太人人群中频率高达0.4%,高于ACMG/AMP指南中支持良性突变的BS1阈值(0.3%),且研究表明在该核苷酸水平上不具有进化保守性,故被误认为良性可能大。值得注意的是,gnomAD数据库显示该位点在欧洲、东亚、南亚、拉丁美洲等多个地区的人群中频率为0,唯独在德系犹太人中频率较高。在CDGC数据库中,该突变在广西壮族人群中的携带率也较高,在听力正常者中检出3例携带者。

3.2同义突变不会改变氨基酸序列,故大量同义突变是没有生物学意义的,尤其是人群频率较高的突变,往往会被当作良性突变而被过滤掉。然而,越来越多的研究表明事实并非如此,同义突变可通过多种机制引起疾病,包括影响剪切、mRNA结构和稳定性、翻译速率、蛋白构象和表达等过程[12-14],在某些情况下,还存在多种机制共同作用诱导疾病表型的可能[13]。其产生明显生物学改变的最常见的方式是干扰前体mRNA剪接,可通过影响剪切增强子或沉默子元件功能,或产生隐匿性供/受体,导致编码异常蛋白或产生不稳定的异常mRNA。有研究报道,剪切增强子或沉默子元件中的同义变体也可通过改变某些mRNA亚型的相对丰度致病,如额颞叶痴呆和家族性生长激素缺乏[15-17]。通过患者的新鲜组织或细胞进行逆转录PCR可鉴定同义突变对剪切的影响,但临床样本的及时获取往往受诸多因素的影响,这也刺激了其他实验方法的发展,如minigene splicing assay。作为体内剪切试验验证的替代技术,在体内样本获取或基因表达量受限时,通过人为构建的minigene重组质粒转染目的细胞,经逆转录PCR产物测序可直观有效地验证mRNA的剪接形式,在诸多疾病研究领域中表现卓越[18-19]。

3.3随着“精准医疗”时代的到来和推进,建立基因型-表型精细化图谱是遗传性疾病进行精准预测、诊断、评估和干预的核心。自1995年在印度尼西亚巴厘岛一村落的耳聋大家系中鉴定出MYO15A所致的ARNSHL后,大量的研究表明该基因突变所致的耳聋表型为先天性双侧全频重度-极重度感音神经性聋[20]。至2007年,Nal等[21]首次报道了MYO15A的N-末端突变可引起低频有残余听力的非重度耳聋表型。随着研究的深入,发现肌球蛋白XVa有2个蛋白亚型,亚型2相较亚型1缺少由2号外显子编码的N-末端区域。因此,这种耳聋表型的差异取决于蛋白亚型2是否正常。随后越来越多的研究证实这一论点,发生在N-末端区域的突变[如MYO15A(p.Tyr289X)、(p.Glu396Argfs*36)、(p.Ser1176Valfs*14)[22]等]仍拥有正常的亚型2,听力表型为低频区有残余听力的感音神经性聋。而非N-末端区域(如Motor、MyTH4 1、FERM1、SH3、MyTH4 2、FERM2及PDZ结构域)发生的突变导致蛋白亚型1和2均异常,听力表型多为先天性双侧重度-极重度感音神经性聋[23]。本研究报道的MYO15A:NM_016239.4:c.9861C>T(p.Gly3287=)位于61号外显子中段区域,编码FERM2结构域。该突变在本研究中所致的耳聋表型为儿童时期的重度-极重度听力损失,Hirsch等[11]在首次报道中总结,大部分患者经新生儿听力筛查,诊断为迟发性进展性耳聋,通过minigene验证阐明其致病机制为该同义突变所致的整个61号外显子跳跃,因此从本质上说它是一个剪切位点的突变。本研究还总结了FERM2结构域附近的所有已报道的截断突变的基因型-表型情况,包括影响剪切突变10个:c.8968-1G>C,c.8968-1G>T,c.9083+6T>A,c.9229+1G>A,c.9229+2T>C,c.9518-2A>G,c.9611_9612+8del,c.9690+1G>A,c.9861C>T,c.9948G>A;移码突变4个:c.9316dup,c.9958_9961del,c.9995_10002dup,c.10573del;无义突变4个:c.9319G>T,c.9514C>T,c.9790C>T,c.10474C>T。其中以纯合突变致病为主,大部分致病位点均表现为双侧重度-极重度语前聋,仅2个位点表现为非重度进展性耳聋(c.9790C>T,c.9861C>T),它们分别为无义突变和影响剪切的同义突变,且均有复合杂合的致病报道。另外,2014年在巴基斯坦一ARNSHL家系中,通过minigene验证后鉴定出位于61号外显子最后一个氨基酸的同义突变MYO15ANM_016239.4:c.9948G>A(p.Gln3316=)[24],同样也会导致61号外显子的跳跃,其耳聋表型为先天性重度-极重度耳聋。因此相同突变致聋的患者仍可表现为不同表型,可能为种族间不同遗传背景的基因修饰作用,也不排除与其复合杂合的另一位点功能丧失效应不同所致,可通过全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)、转录组测序(RNA-sequencing,RNA-Seq)及细胞和动物实验进一步探究。

综上,本研究确定了MYO15A基因的一个同义突变在中国人群的致病性,可导致早发的重度-极重度耳聋。该位点在中国广西壮族及德系犹太人人群中携带率相对较高。对于这种在某些地区富集较明显的位点,过滤分析时应格外注意,高频与同义突变并非过滤的绝对指标。