ESPN基因罕见纯合突变导致常染色体隐性遗传耳聋的基因诊断及人工耳蜗康复效果评价

刘 燕, 钟鸣骏, 熊文羽, 彭 婉, 卢 宇

耳聋是临床上最常见的感觉神经系统缺陷之一,据2021年《世界听力报告》统计,目前全世界存在不同程度听力损失的人数超过15亿,预计到2050年可能会增加到25亿人[1]。第二次全国残疾人抽样调查显示,我国听力障碍残疾人口有2 780万人,占残疾人总数的33.5%[2]。耳聋在我国是常见的出生缺陷,其中遗传因素占早发性耳聋病因的60%以上,常染色体隐性遗传是最主要的遗传方式[3]。根据是否合并其他系统疾病,耳聋分为非综合征型和综合征型,其中非综合征型约占70%。目前已报道超过120个导致非综合征型耳聋的基因,在中国人群中最常见的GJB2、SLC26A4、OTOF、MYO15A和MYO7A等常染色体隐性遗传耳聋基因已有大量文献报道。对早发性重度以上感音神经性听力损失,尽早施行人工耳蜗植入和言语康复训练是最有效的治疗方法[4]。人工耳蜗是通过体外设备采集声音信号,经信号处理后无线传输至植入头皮下的信号处理装置,再将电信号传送至植入耳蜗的电极,电极通过放电直接刺激听神经,最终信号传到大脑,从而感知声音。人工耳蜗传导的听觉信号绕过耳蜗病变部位,直接刺激患者的螺旋神经节细胞和听神经,帮助患者改善或获得听觉。因此,大多数耳聋患者在人工耳蜗植入术后配合规范的听力和言语康复训练可获得不同程度的听力和言语功能的提高。但临床上也有部分患者在人工耳蜗植入后康复效果不佳,这不仅与植入年龄、言语康复训练等因素有关,还与患者耳聋的病变部位和病理机制有关[5]。不同的基因突变导致耳聋的病理机制和病变部位存在差异,因此可能造成人工耳蜗效果的差异。通过基因诊断明确患者听觉系统的分子病理学改变,有助于对人工耳蜗植入的预后进行评估,避免无效植入。本研究通过二代测序在1例语前极重度非综合征型耳聋患者中发现ESPN基因c.1916-1G>A纯合突变,明确了罕见的剪切位点新突变是该家庭的致聋原因,并对ESPN基因导致耳聋的遗传特点、临床表型和人工耳蜗康复效果进行总结分析。

1 对象与方法

1.1研究对象 本研究家系是来自广西壮族自治区的壮族家系。采样小组对先证者及其亲属成员进行了家系调查,收集家系成员临床资料,对先证者进行详细病史资料收集(包括现病史、既往史、母亲围生期风险和用药史等),进行常规体格检查、听力学检查等。采集各家庭成员外周静脉血5 ml,提取基因组DNA冻存备用。本研究获四川大学华西医院伦理委员会批准[批号:2021年审(190)号],参与研究的家系成员均签署知情同意书。

1.2全基因组检测和数据分析 使用华大智造DNBSEQ-T7测序平台对先证者血液提取到的DNA进行全基因组测序,下机原始数据使用BWA软件与参考基因组序列(GRCh38)进行比对,使用基于GATK Haplotype Caller开发的Saile calling算法提取突变信息。对突变进行质量控制过滤:read depth>6,genotype qualities>20,allele frequency>10%。使用VarSeq软件对突变进行人群频率(gnomAD、dbSNP、1000 Genomes人群数据库)注释,过滤次等位基因频率(minor allele frequency,MAF)≥0.005的突变位点;过滤掉ClinVar数据库注释为Benign的突变。筛选耳聋基因编码区和剪切位点区域的突变,对候选突变进行致病性分析。

1.3Sanger测序验证 根据二代测序检出的候选致病基因突变,设计验证引物,对家系相关成员进行双向Sanger测序验证。测序数据通过质控后,应用Mutation-Surveyor软件进行序列比对,判读基因型,分析检出突变是否符合家系内听力表型和基因型共分离。

1.4人工耳蜗术后听觉与言语康复效果评价 应用有意义听觉整合量表(Meaningful Auditory Integration Scale,MAIS)和有意义使用言语量表(Meaningful Use of Speech Scale,MUSS)对患儿/先证者的实际交流环境下的听觉能力与言语能力进行有效评估[6]。MAIS总分为40分,得分越高提示患者听觉能力发展越好。MUSS由患儿家长对开放式问题进行详细回答,可通过举例对患儿日常生活中言语行为进行详细描述,评估者根据患儿家长对言语发生行为出现频率的描述进行评分,每个问题的分值为0～4分,总分为40分,分数越高提示患儿的言语能力越强。

2 结果

2.1患儿病史及临床表现 先证者男性,1岁时父母发现患儿听力下降,4岁就诊于当地医院耳鼻咽喉头颈外科门诊,进行纯音测听、声导抗、听性脑干反应、畸变耳声发射等详细听力学评估,以及颞骨CT扫描检查,结果提示为双侧对称的重度感音神经性耳聋,无内耳畸形,无前庭功能障碍,无其他系统疾病,无头部外伤史、耳毒性药物及噪声暴露史,母亲围生期无特殊疾病和药物接触史。父母听力正常,非近亲婚配,无耳聋家族史。患儿4岁进行了右耳人工耳蜗植入手术,术后无并发症,开机正常,在当地康复机构进行2年言语康复训练。

2.2致病基因鉴定结果 对先证者进行全基因组测序,下机数据通过质控、去重和过滤后,根据遗传方式、表型特征、VEP Impact注释等条件进行筛查后得到1个候选基因突变:ESPN基因纯合突变c.1916-1G>A。该突变此前未见报道,在gnomAD数据库中未检出。

2.3Sanger测序验证结果 结果表明,患儿基因型为ESPN基因c.1916-1G>A纯合突变。患儿父母听力正常,均携带c.1916-1G>A杂合突变。先证者的纯合突变分别来自于父母,家系内基因型与表型共分离,初步推断ESPN基因c.1916-1G>A纯合突变为患儿耳聋的致病原因。家系图及Sanger测序图谱见图1。

2.4突变致病性分析结果 先证者检出的ESPN基因c.1916-1G>A是剪接位点突变,通过影响mRNA剪接导致转录过程中相应外显子缺失,从而生成截短蛋白,造成功能缺陷。该突变在gnomAD等人群数据库中均未检出,属于极罕见突变;该突变在家系中符合基因型-表型共分离,符合常染色体隐性遗传方式。总结ESPN基因在ClinVar和DVD数据库已报道的致病性突变[7-19],本研究发现的截短突变是ESPN基因常染色体隐性遗传方式最常见的突变类型(见图2),c.1916-1G>A导致截短蛋白缺失了重要的功能域(见图3)。ESPN基因c.1916-1G>A为致病性突变。

ClinVar和DVD数据库收录的致病性和可能致病性突变,以及本研究发现的突变:错义突变9个,框内突变1个,移码突变7个,无义突变5个,剪切突变2个

图示Espin蛋白结构及突变所在结构域;绿色字体为本研究发现突变,红色字体为常染色体显性遗传突变,黑色字体为常染色体隐性遗传突变

2.5人工耳蜗术后听觉与言语康复效果评价 患儿术后在当地言语康复机构学习2年,术后5年进行康复效果评估。患儿父母认为康复效果良好,能够通过人工耳蜗进行日常言语沟通。MAIS评分得分35分(总分40分),MUSS评分得分38分(总分40分),证明其听觉与言语康复效果良好。

3 讨论

3.1本研究报道了1例语前重度感音神经性耳聋患儿,通过全基因组测序检出ESPN基因c.1916-1G>A纯合突变,这是通过改变mRNA剪接导致基因功能缺陷的致病性突变,患儿表型符合ESPN基因导致的常染色体隐性遗传非综合征型耳聋典型特征,因此ESPN基因c.1916-1G>A纯合突变是该患儿的致病原因。

3.2ESPN基因由13个外显子组成,编码854个氨基酸的Espin蛋白,是一种肌动蛋白结合蛋白。在Espin的N端有8个重复的锚蛋白(ankyrin repeats),在2个富含脯氨酸的区域(PR1和PR2)中间是1个肌动蛋白结合域xAB,接着是WH2结构域,其包含ATP或GTP共同结合位点,在C末端有2个肌动蛋白结合位点构成ABM模块[20]。Espin蛋白在内耳毛细胞纤毛中表达,纤毛是内耳毛细胞顶端表面突出的特殊微绒毛,其核心由平行的肌动蛋白丝束密集排列而成[21]。Espin可交联肌动蛋白丝使立体纤毛的肌动蛋白丝束规律排列,不同浓度的Espin可以决定蛋白丝延伸的程度,从而决定平行的肌动蛋白丝束的长度[22]。研究发现小鼠中ESPN基因纯合突变会导致毛细胞缺陷从而引起耳聋和前庭功能障碍[23]。

3.3ESPN基因缺陷导致的常染色体隐性遗传耳聋典型表现为学语前发病的重度或极重度感音神经性耳聋,部分患者可合并前庭功能障碍。Naz等[7]2004年报道了2个巴基斯坦的语前极重度耳聋合并前庭功能障碍的近亲婚配家系,通过连锁分析,这2个常染色体隐性遗传家系的致病基因均定位于1p36.3,并最终鉴定致病基因均为ESPN基因。Donaudy等[24]2006年报道了ESPN基因杂合突变导致的常染色体显性遗传耳聋,报道的4例患者表型差异较大,发病年龄4～42岁,听力损失程度为轻度至重度不等,但其基因型表型关联尚缺乏确定性证据。

3.4目前对ESPN突变导致耳聋的病例报告较少,在ClinVar和DVD数据库中收录导致非综合征型耳聋的致病性和可能致病性的突变一共27个,其中23个导致常染色体隐性遗传耳聋的突变类型以截短突变(包括移码突变、无义突变和剪切突变)为主。ClinVar数据库中有一个剪切突变位点(c.1916-1G>C)与本研究发现的突变(c.1916-1G>A)位置一致,都会通过影响剪接导致基因功能缺陷,这也进一步验证了本研究报道突变的致病性。

3.5ESPN基因已报道的致病性突变中,以常染色体隐性遗传耳聋为主,只有4个非截短突变(错义突变和框内突变)为常染色体显性遗传,提示两种遗传方式可能是不同突变致病机制造成的。导致常染色体显性遗传耳聋的突变主要集中在肌动蛋白结合位点ABM模块中,该位置的突变可能使Espin与肌动蛋白丝交联失败,导致纤毛病变而致病。

3.6已报道的常染色体隐性遗传耳聋家系中大部分为近亲婚配[7-8],而本研究中发现的广西家庭为非近亲婚配家庭,但患者检出极罕见突变的纯合子。基因突变频率及热点突变具有种族特异性和民族特异性,在不同的地区和民族中,耳聋基因突变谱和优势突变不同,本研究中发现的突变位点在各人群数据库中均未检出,其是否为广西当地民族特异性突变有待进一步研究。

3.7对于重度和极重度感觉神经性听力损失的患者,人工耳蜗植入是最有效的治疗方法。目前全球有65万人接受了人工耳蜗植入,但是约有7%患者听觉植入后效果差,有多方面的原因[5]。其中遗传因素很重要,除GJB2、SLC26A4基因突变患者人工耳蜗植入效果明确以外,其他基因突变对人工耳蜗植入效果的报道很少。ESPN基因缺陷患者的人工耳蜗植入效果此前未见报道,不能形成术前评估的指导性意见。本研究中患者人工耳蜗术后经过系统性言语康复训练,言语康复效果良好,证实ESPN基因c.1916-1G>A纯合突变致耳聋可以进行人工耳蜗手术,为人工耳蜗术前评估提供遗传学参考证据。

对全国不同区域及民族的耳聋人群进行深入研究,明确各地区各民族耳聋基因的诊断率、特定耳聋基因突变的人群频率等特点,能够为遗传性耳聋基因筛查和基因诊断提供更加准确的参考依据,对制定精准的遗传咨询服务和人工耳蜗植入评估具有重要意义。