广西地区先天性耳聋患者及其家系成员常见耳聋基因突变特点分析

林钻平, 贠 露, 甘函箫, 徐慧兰, 唐凤珠, 唐 杰, 陈睿春, 李凤提, 林敢生

耳聋是残疾的主要病因之一,严重影响患者交流、学习和生活。据统计,2015年全球约有5亿耳聋患者[1],每1 000名新生儿就有1～3例罹患听力残疾,其中主要由遗传因素所导致者约占一半以上[2]。耳聋常见病因包括遗传因素和环境因素,大部分患者为非综合征型耳聋(nonsyndromic hearing loss,NSHL),约占70%。我国最常见的遗传性耳聋基因是GJB2、SLC26A4、线粒体12S rRNA、GJB3[3]。目前,对于我国人群听力障碍的患病率调查研究较少,最近的数据可追溯至2006年第2次全国残疾人抽样调查,其结果显示,听力残疾者约有2 780万人。2010年广西听力残疾人抽样调查结果显示,听力残疾在残疾人口中占比最高,约有84.8万人[4]。本课题组的前期研究发现,广西感音神经性聋患者耳聋基因突变率低于全国平均水平,其主要突变基因是GJB2,其次是SLC26A4[5]。为进一步了解广西耳聋基因突变情况,本研究通过耳聋基因芯片对广西336例先天性耳聋患者及其家系成员进行筛查,分析其基因突变特征,现报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 招募2017年12月至2022年12月我院耳鼻咽喉头颈科门诊收治的NSHL先证者及其直系血缘亲属共336例作为研究对象。纳入标准:(1)符合诊断标准的先天性遗传性耳聋患者,且父母双方三代均为广西人,长期居住在广西20年以上;(2)患者和家属同意参加本研究并签署知情同意书。排除标准:(1)诊断为非遗传性耳聋患者(如传导性耳聋)或伴有全身疾病者、智力障碍者,既往有脑炎、脑膜炎、腮腺炎等明确非遗传因素致聋病史者;(2)家族三代内有外地迁移或者有与省外或国外种族联姻家族史的患者;(3)患者和家属不同意参加本研究。本研究经医院医学伦理委员会批准(科研广西科技-2017-29号)。

1.1.1 耳聋家系招募 招募到21个耳聋家系(先证者21例),耳聋患者52例,听力正常的亲属30例,共82例。其中男42例,女40例;年龄1～52岁,平均年龄20.81岁。根据耳聋程度分类:双耳极重度感音神经性聋34例,双耳中度感音神经性聋3例,双耳轻度感音神经性聋5例,双耳轻度传导性聋1例,左耳轻度感音神经性聋2例,左耳重度、右耳极重度感音神经性聋2例,右耳重度、左耳极重度感音神经性聋1例,左耳重度、右耳中度感音神经性聋1例,左耳极重度感音神经性聋1例,右耳轻度感音神经性聋1例,左耳重度混合性聋1例。

1.1.2 散发耳聋招募 招募到散发耳聋患者106例,其听力正常直系血缘亲属148例,共254例。其中男124例,女130例;年龄4个月～56岁,平均年龄22.3岁。根据耳聋程度分类:双耳极重度感音神经性聋91例,双耳重度感音神经性聋7例,双耳中度感音神经性聋4例,右耳重度、左耳极重度感音神经性聋1例,右耳极重度、左耳重度感音神经性聋1例,左耳极重度感音神经性聋1例,右耳极重度感音神经性聋1例。

1.2听力学评估方法 参照世界卫生组织防聋和听力损失项目报告(1997年,日内瓦),以0.5、1.0、2.0、4.0 KHz频率计算平均听阈,听力损失分为4级:(1)轻度聋:26～40 dB HL;(2)中度聋:41～60 dB HL;(3)重度聋:61～80 dB HL;(4)极重度聋:≥81 dB HL。成人主要采取纯音测听(pure tone audiometry,PTA)检查,对于不能完成主观听力检查的患儿采用客观听力检查[听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检查、耳声发射(otoacoustic emisson,OAE)检查和多频稳态诱发电位(multiple auditory steady-state evoked responses,ASSR)检查]进行评估。

1.3基因检测方法 采集研究对象外周静脉血3～5 ml,避免震荡,-20 ℃保存备检,并建立纸质及电子档案。应用亚能生物技术(深圳)有限公司生产的核酸提取试剂[粤深械备20150099号;型号:全血DNA(离心柱型)]及其配套仪器进行多重PCR扩增、芯片杂交、洗涤及扫描,检测样本4个常见致聋基因的16个常见突变位点:GJB2(35delG、176-191del16、235delC、299-300delAT),GJB3(538C>T、547G>A),SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A),线粒体12S rRNA(1494C>T、1555A>G)。根据荧光杂交信号和耳聋基因微阵列芯片探针排布位置进行信号读取及结果判读。见图1。

ⓐ野生型；ⓑGJB2 235delC杂合突变；ⓒGJB2 235delC纯合突变；ⓓGJB2 299-300delAT杂合突变；ⓔGJB2 176-191del16杂合突变；ⓕGJB2 176-191del16/235delC复合杂合突变；ⓖSLC26A4 IVS7-2A>G杂合突变；ⓗSLC26A4 1229C>T杂合突变；ⓘSLC26A4 IVS7-2A>G/1229C>T复合杂合突变；ⓙ线粒体12S rRNA 1494C>T突变

2 结果

2.1耳聋患者基因突变检出情况及突变特征 158例耳聋患者中共检出常见耳聋基因突变24例(15.19%,24/158)。其中SLC26A4基因突变15例(9.49%,15/158),GJB2基因突变8例(5.06%,8/158),线粒体12S rRNA突变1例(0.63%,1/158)。见表1。

表1 158例耳聋患者基因突变检出情况及突变特征

2.2听力正常耳聋患者亲属基因突变检出情况及突变特征 178例听力正常的耳聋患者亲属共检出22例基因突变,检出率为12.36%(22/178)。其中SLC26A4基因突变12例(6.74%,12/178),GJB2基因突变10例(5.62%,10/178)。见表2。

表2 178例听力正常耳聋患者亲属基因突变检出情况及突变特征

3 讨论

3.1耳聋是一种严重影响患者身心健康的疾病,对患者的情感和认知发展都有深远影响。研究表明,一半以上的耳聋与遗传密切相关,遗传性耳聋中,先天性NSHL占70%左右,约80%的病例为常染色体隐性遗传,15%为常染色体显性遗传,1%～2%为线粒体或X连锁遗传。迄今为止,已经发现了140多个与耳聋密切相关基因[6]。我国常见的NSHL致病基因有GJB2、SLC26A4、GJB3和线粒体12S rRNA,还有新近发现的MYO7A及TECTA基因等[3]。对这些基因开展研究可帮助研究者从分子水平上认识耳聋遗传学,并可为患者提供个性、精准的临床咨询。

3.2GJB2基因是世界各地导致遗传性耳聋的最常见突变基因,是常染色体隐性遗传性耳聋的主要致病基因[7]。GJB2的突变导致Cx26蛋白在耳蜗中异常表达,Cx26蛋白是维持钾离子循环通路的重要因子,其异常表达会使内耳淋巴液中钾离子失衡,导致听力损害[8]。目前已知的GJB2基因突变类型有100余种[9],我国最为常见的是235delC,235delC突变导致第79位密码子后面发生移码突变[10]。Koohiyan等[11]针对332个不相关的家族开展研究,发现GJB2突变的平均频率为16%,且通过对PubMed数据库进行系统搜索发现,不同种族群体的GJB2突变率存在差异。我国不同地区GJB2突变频率也不尽相同,Dai等[12]研究显示我国不同地区NSHL患者中GJB2突变的频率为4%～30.4%,湖南地区耳聋患者的GJB2基因突变检出率为22.08%(34/154)[13],山西太原地区的GJB2基因突变检出率为20.16%(26/129)[14],浙江地区的检出率则为24.81%(452/1 822)[15]。本研究结果显示,广西地区158例先天性耳聋患者中GJB2基因突变检出率为5.06%(8/158),低于上述我国其他地区研究的检出率,可进一步扩大样本量进行验证。本研究中有1例患儿检出GJB2 c.235delC纯合突变,遗传自均是GJB2 c.235delC单杂合突变的父母;另1例患儿检出GJBc.176-191del16/c.235delC复合杂合突变,父母分别是GJBc.176-191del16和GJBc.235delC单杂合突变,明确了致病基因。其余6例患者检出GJB单杂合突变,提示可能存在同一基因的不同位点突变,可通过基因靶向测序明确病因。有10例听力正常者检出GJB杂合突变为隐性携带者,后续可对其配偶进行该基因检测,以提供优生建议。

3.3SLC26A4基因是我国第二大常见耳聋基因,突变检出率仅次于GJB2基因。SLC26A4基因突变可以通过一系列病理、生理改变导致耳聋,其可编码具有生理功能的Pendrin蛋白,主要表达于内淋巴管、内淋巴囊等结构中,参与氯离子的跨膜转运,维持内耳中内淋巴液系统的离子平衡状态[16]。内耳是听觉系统的重要构成部分,有感音、声音-生物信号传递等重要生理功能。有研究显示,我国SLC26A4基因突变携带率为2%～3%。该基因突变极易导致大前庭导水管综合征,97.9%的大前庭导水管综合征患者携带SLC26A4基因突变[17]。大前庭水管综合征患者听力下降的发病时间一般较晚,且发病及病情加重多与导致颅内压升高的诱发因素有关,包括感冒、头部外伤等。通过耳聋基因检测和影像学检查可早期筛查此类患者,及早干预,有利于降低重度、极重度耳聋的发病率。在我国不同地区耳聋人群中,SLC26A4基因突变频率为4.76%～24.4%,其中广西柳州的SLC26A4基因突变频率为6.21%[18]。在本研究中,158例耳聋患者中有15例(9.49%)检出SLC26A4基因突变。而针对全部336例的SLC26A4基因常见突变位点筛查结果显示,基因突变检出率为8.04%(27/336),是本组研究人群中排名第1位的致聋基因,提示本地区SLC26A4基因突变携带率可能处于高发水平。

3.4线粒体12S rRNA突变是引起药物性耳聋的常见致病因素,属于母系遗传。Prezant于1993年首次证实mtDNA突变存在于氨基糖苷类抗生素使用导致的耳聋,使得遗传因素在药物性耳聋发病中的重要性逐渐受到重视。此后,临床上开始关注这种特殊的耳聋,携带线粒体12S rRNA基因突变的人群有很大风险在常规使用氨基糖苷类抗生素时造成不可逆的听力下降。目前,对于线粒体12S rRNA研究比较多的是1555A>G和1494C>T突变,因为这2个位点突变会在12S rRNA高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对,改变氨基糖苷类的结合位点,使人类的线粒体核糖体与细菌的相似,更易与氨基糖苷类抗生素结合,诱发或加重携带这些突变个体的听力损害[19]。有针对山东地区新生儿耳聋基因及听力筛查的结果显示,线粒体12S rRNA突变检出率达0.21%[20];而针对成都地区1 427例听力障碍患者的筛查发现,线粒体12S rRNA突变率高达5.96%[21]。本组研究发现1例线粒体12S rRNA 1494C>T突变患者,在耳聋患者中的检出率为0.63%,低于上述研究结果,虽未能对其母亲进行采样,但可根据检测结果指导该家系成员用药,避免其后代因使用氨基糖苷类药物而致聋。

3.5GJB3基因是1998年在我国本土克隆和鉴定的第一个耳聋致病基因[22],可引起常染色体隐性或显性遗传性NSHL。综合诸多文献报道结果,笔者认为该基因突变率整体偏低,且国内各地区差异较大。本组336例受检者均未检出GJB3基因突变,后期进一步扩大检测,若仍未发现GJB3基因突变,则可以考虑暂不纳入广西地区先天性遗传性耳聋的常规基因检测中。

综上所述,SLC26A4和GJB2是广西地区人群遗传性耳聋的常见突变基因,其中SLC26A4c.IVS7-2A>G位点突变率最高(6.85%,23/336),其次为GJB2c.235delC突变(3.87%,13/336)。本组耳聋人群中与筛查位点有关的突变比例高达15.19%,与国内相关研究相似,其中耳聋患者家属基因突变检出率达12.36%,说明热点突变在耳聋人群中存在比例高,有必要在耳聋人群体中进行热点突变位点的筛查,其中SLC26A4c.IVS7-2A>G和GJB2c.235delC应列为广西耳聋基因筛查的常规检测项目,为生育咨询提供信息。