伊马替尼联合重组人干扰素α-2b治疗加速期慢性髓性白血病患者的疗效及对血清MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平的影响

王 晖, 李艳春, 高秋英, 张 玎, 郑 研

慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种血液恶性肿瘤,在中老年人群发生率较高,其中以男性患者居多[1]。其发病机制是生成大量不成熟细胞,堆积于骨髓,导致骨髓造血功能障碍,临床可表现为贫血、感染、出血等,以肝、脾肿大,以及消瘦、盗汗最为常见。临床上常以基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的水平作为衡量肿瘤活性的标准[2]。MMP-2破坏细胞基膜,加快胞外基质降解[3]。婆罗双树样基因4(spalt-like transcription factor 4,SALL4)是果蝇中婆罗双树基因同源基因SALL中的一类,含有锌指结构域的新反式作用因子,对于保护胚胎干细胞功能具有重要作用。SALL4位于染色体20q13.13-13.2区域,该区域突变通常与肿瘤发生有关[4]。血清α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein,AGP)属于急性时相反应蛋白,与恶性肿瘤发生、发展具有关联性[5]。伊马替尼属于酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)抑制剂,对治疗CML具有持久的血液和遗传学反应,可有效缓解病情,是目前CML的一线治疗药物。干扰素可与细胞膜上的受体结合,促进蛋白质合成,降低肿瘤基因的表达水平。重组人干扰素α-2b(recombinant human interferon α-2b,IFNα-2b)是CML的传统治疗药物,但长时间使用会降低治疗效果。IFNα-2b与伊马替尼联合使用能产生协同效应,提高疗效[6]。然而,目前关于伊马替尼联合IFNα-2b治疗加速期CML患者的研究尚少,其对血清MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平影响的研究更为鲜见。鉴此,本研究旨在探讨伊马替尼联合IFNα-2b治疗加速期CML患者的疗效以及对血清MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平的影响,为优化临床CML的治疗方案提供参考。

1 对象与方法

1.1研究对象 招募2017年1月至2021年1月陕西省人民医院收治的加速期CML住院患者90例。采用随机数字表法将其分为观察组(采用伊马替尼联合IFNα-2b治疗,45例)和对照组(采用伊马替尼治疗,45例)。两组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。研究获医院医学伦理委员会批准(批号:L164835),研究对象均签署知情同意书。

表1 两组基线资料比较

1.2纳入与排除标准 纳入标准:(1)符合《中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南(2016年版)》[7]中关于CML的诊断标准,Ph染色体和(或)BCR-ABL融合基因阳性[8];(2)加速期CML患者,即原始细胞占比为10%～19%,外周血中嗜碱性粒细胞≥20%,对治疗无反应或非治疗引起的持续血小板减少(<100×109/L)或增高(>1 000×109/L),治疗过程中出现基于Ph染色体的克隆演化,呈现出进行性脾增大或白细胞增高[9];(3)年龄≥18岁。排除标准:(1)合并其他疾病,需使用与研究药物可能存在相互作用的药物;(2)近期接受过TK抑制剂治疗且未过洗脱期;(3)合并吸收障碍或存在影响药物吸收的其他疾病;(4)合并心、肝、肾等重要脏器疾病;(5)曾接受过造血干细胞移植术;(6)妊娠期和哺乳期妇女。

1.3治疗方法 对照组给予甲磺酸伊马替尼片(江苏豪森药业股份有限公司,国药准字H20133200,规格0.1 g×12片)治疗,初始治疗剂量为400 mg/d,进餐时服药,1次/d,出现耐药后(治疗后效果不明显),剂量增至600～800 mg/d。出现药物不良反应(主要为胃肠道反应导致的恶心呕吐、腹痛腹胀等现象;骨髓抑制导致的白细胞下降、血小板降低;肿瘤破溃出血、肝肾功能损伤)则立即停药。观察组在对照组的治疗基础上给予IFNα-2b注射液(北京凯因科技股份有限公司,国药准字S20030030,规格0.3 ml∶300万IU),300万IU/次,隔天肌内注射1次。两组均持续治疗6周。

1.4观察指标

1.4.1 临床疗效 参考《中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南(2016年版)》[7],于治疗期结束后进行评估。(1)完全血液学缓解(complete hematological remission,CHR):P190和P210的BCR-ABL融合基因分别下降2.9和2.0个对数;(2)完全细胞遗传缓解(complete cytogenetic remission,CCyR):要求至少检查20个有丝分裂中期相,未见Ph染色体;仅存在b2a2和(或)b3a2 BCR-ABL1转录本的患者进行分子学缓解评估。(3)主要分子学反应(major molecular response,MMR):BCR-ABL1转录本水平≤0.1%。

1.4.2 血清学指标 于治疗前后抽取患者空腹静脉血5 ml,离心后取上清液。通过微孔板检测器(北京诺汇诚科技有限公司,Spark 10M)采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及MMP-2水平。试剂盒均购自上海科艾博生物技术有限公司,检测方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.3 SALL4 mRNA表达水平 于治疗前后抽取患者静脉血2 ml,分别置于经乙二胺四乙酸处理的15 ml无酶离心管内。30 min内进行以下操作:在离心管内加入3 ml红细胞裂解液,轻轻振荡混匀后静置10 min,室温下470×g离心5 min,弃上清液。重复裂解红细胞1次,加入1 ml Trizol试剂,-70 ℃保存备检。采用Trizol法提取标本总RNA,以紫外分光光度仪测定总RNA含量。每份标本取总RNA 1 μg,通过逆转录试剂盒将其逆转为cDNA,并以cDNA为模板进行实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR),扩增片段长度为143 bp。反应总体积25 μl:cDNA 50 ng、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl 24.0 mmol/L、上下游引物各0.4 μmol/L、EvaGreenPCR核酸染料(20×水溶液)1.2 μl、50×荧光参比溶液0.5 μl、DNA聚合酶1.0 U。所用引物序列见表2。所用仪器为PE9600型PCR扩增仪(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。反应条件:94 ℃预变性4 min,变性30 s、61 ℃(ABL 60 ℃)退火30 s、72 ℃延伸30 s、84 ℃(ABL 82 ℃)收集荧光30 s,共50个循环。每次实验均设立通过测序证实序列无误的SALL4 cDNA阳性标本作为阳性对照,以双蒸水作为无模板阴性对照。采用SDS软件分析检测数据,以ABL为内参计算SALL4转录本的相对定量,NSALL4=SALL4转录本的拷贝数/ABL的拷贝数×100%。

表2 引物序列

1.4.4 AGP水平 于治疗前后抽取患者空腹静脉血5 ml,3 500 r/min离心10 min,取血清,-80 ℃保存备检。采用抗原抗体结合动态测定方法(免疫散射比浊法)对AGP进行检测。将以等渗盐水1∶10稀释的3 μl血清加入300 μl α1-AGP抗体液,充分混匀。延迟时间5～10 s,反应时间5 min,反应温度37 ℃,测定波长为340 nm。所用仪器为特定蛋白分析仪BN ProSpec(天津通怡科技有限公司),试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。

1.4.5 不良反应 观察患者治疗期间不良反应发生情况,包括白细胞减少[低于正常范围(4～10)×109/L]、血小板减少(<100×109/L)、水肿、恶心、呕吐、头疼、发热的发生情况。

2 结果

2.1两组临床疗效比较 观察组治疗后获CHR的人数比例较对照组更高,获CCyR、MMR的人数比例低于对照组,观察组整体疗效优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组临床疗效比较[n(%)]

2.2两组治疗前后血清学指标水平比较 两组血清IL-6、PGE2、ALP、MMP-2治疗前水平比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后均较治疗前显著降低(P<0.05),且观察组较对照组更低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 两组治疗前后血清学指标水平比较

2.3两组治疗前后SALL4 mRNA表达水平比较 两组治疗前SALL4 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后较治疗前显著降低(P<0.05),且观察组较对照组更低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 两组治疗前后SALL4 mRNA表达水平比较 相对表达量]

2.4两组治疗前后血清AGP水平比较 两组治疗前血清AGP水平比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后较治疗前显著降低(P<0.05),且观察组较对照组更低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 两组治疗前后血清AGP水平比较

2.5两组不良反应发生情况比较 观察组白细胞减少4例,血小板较少6例,血液学不良反应发生率高于对照组[22.22%(10/45)vs 6.67%(3/45);χ2=4.406,P=0.039]。两组非血液学不良反应发生率比较差异无统计学意义[6.67%(3/45)vs 4.44%(2/45);χ2=0.000,P=1.000]。两组总不良反应发生率比较差异有统计学意义(P<0.05)。两组出现不良反应的患者均采取对症治疗后好转。见表7。

表7 两组不良反应发生情况比较[n(%)]

3 讨论

3.1CML在慢性白血病中占比较高,患者一般表现为贫血、身体乏力、身体素质下降、肝脾区不适等。这些症状并未表现出特异性,常未能引起患者及其家属足够的重视而延误诊治,使得大部分患者确诊时已处于疾病加速期,严重影响患者预后[8]。CML具有Ph染色体,即染色体异常[9]。染色体异常产生的BCR/ABL融合基因可启动下游多条信号转导通路,这也是CML的发病机制。流行病学调查研究结果显示,我国每年CML发病率达(0.39～0.99)/10万,占所有白血病的10%左右,以中年人群最为常见,其中男性患者相对较多[10]。

3.2CML传统的治疗方法有重组人干扰素-α、化疗及干细胞移植等[11]。重组人干扰素-α可对DNA多聚酶的活性产生抑制作用,提升Ph(+)细胞人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分子的表达水平,可识别Fas介导的细胞凋亡、调节因子的基因表达、抗原递呈细胞和T淋巴细胞,继而发挥抗肿瘤、提升机体免疫力、抑制肿瘤细胞增殖等作用[12]。伊马替尼属于2-苯胺嘧啶衍生物,可对TK的活性产生抑制作用,阻断细胞间的信号转导,同时可诱导肿瘤细胞生长阻滞以及凋亡,发挥治疗CML的作用。其应用于临床具有起效快、作用时间长和减少肿瘤负荷等优点,然而一部分患者可发生伊马替尼耐药,导致治疗失败。与单独伊马替尼治疗比较,联合IFNα-2b治疗可使患者更早获得较好的遗传学反应,且在后期仍可获得较好的分子学反应。通常而言,分子学反应的提升表明患者生存质量的提升,可减少残留的微小病灶,因此对肿瘤患者的预后改善具有一定的价值。本研究伊马替尼联合IFNα-2b治疗并未发现新的严重并发症,血液学不良反应发生率显著高于单独伊马替尼治疗,非血液学不良反应与单独伊马替尼治疗比较无显著差异,与刘玺等[13]的研究结果相似。

3.3本研究观察组治疗后获CCyR、MMR的人数比例低于对照组,获CHR的人数比例高于对照组,提示伊马替尼联合IFNα-2b治疗的临床疗效优于单独伊马替尼治疗,能够缓解患者的病情,促进肿瘤细胞凋亡,考虑这与伊马替尼和IFNα-2b联合使用具有协同作用有关。另外,本研究两组治疗后血清IL-6、PGE2、ALP、MMP-2水平均较治疗前显著降低,且观察组水平较对照组更低,说明伊马替尼联合IFNα-2b治疗对患者肿瘤的抑制作用更强。MMP-2在肿瘤细胞跨基膜侵犯肝脏、脾脏和淋巴结等器官中发挥着十分重要的作用,治疗药物可控制肿瘤细胞合成MMP-2,抑制新生血管的形成,阻止癌细胞转移[14]。

3.4根据细胞癌变假说的分子模型,在造血干细胞异常转化为白血病的过程中SALL4基因可能是较早发生突变的癌基因。SALL4基因在白血病中表达水平升高,使失去自我更新能力的过渡性增生性细胞群体定向祖细胞获得自我更新能力,使其有机会转化为白血病干细胞,这可能是SALL4参与白血病发生机制的途径。SALL4可结合WNT信号通路中的重要调节蛋白β-catenin,从而增强此信号通路活性,激活下游靶基因,导致肿瘤细胞无限增殖,从而引发白血病。本研究两组治疗后SALL4 mRNA表达水平较治疗前显著降低,且观察组水平较对照组更低,提示药物通过下调SALL4基因而阻断WNT信号通路,继而对下游靶基因的表达产生抑制作用,最终对肿瘤细胞增殖产生抑制作用[15-16]。

3.5本研究两组治疗后血清AGP水平较治疗前降低,且观察组下降幅度较对照组更显著,分析认为白血病发生过程中AGP的这种变化可能与肿瘤细胞刺激肝脏和肿瘤细胞自身合成糖蛋白存在一定的关系[17-18]。治疗过程中,药物对肿瘤细胞的杀伤力较大,被杀灭的肿瘤细胞释放糖蛋白;而这种杀伤过程也会对正常组织产生损伤作用,患者可表现出急性时相反应,刺激肝脏合成更多的糖蛋白。上述两个因素均使血清AGP水平升高,对于治疗后病情缓解的患者,机体组织损伤逐渐恢复,白细胞数量下降,AGP水平也随之下降[19-20]。本研究观察组白细胞、血小板减少等血液学不良反应发生率显著高于对照组,而水肿、恶心、呕吐、头疼、发热等非血液学不良反应发生率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),对此需要进一步加大样本量进行验证。

综上所述,伊马替尼联合IFNα-2b治疗加速期CML的效果较单独使用伊马替尼更优,可降低患者MMP-2、SALL4 mRNA和AGP水平,起到缓解病情的作用,但可能会增加其血液学不良反应的发生风险。本研究为单中心研究,样本量较小,研究结论还需进一步通过多中心、前瞻性研究加以验证。