血清miR135a-5p在肺癌患者辅助诊断中的应用价值

周宇 殷雪瑞 陈思宇

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别占全部恶性肿瘤的20.03%和26.99%,居恶性肿瘤的首位[1]。肺癌早期症状隐匿,超过80%患者就诊时已处于中晚期,手术、放疗、化疗等治疗效果不理想[2]。目前,肺癌诊断主要依赖于病理学和和影像学。美国国立肺筛查试验(national lung screening trial,NLST)建议无症状肺癌高危人群每年应进行低剂量CT检查[3],但是CT检查成本较高,推广难度大,而且常规CT筛查难以有效鉴别部分肺结节和较小的肺部肿瘤;而病理学诊断为有创检查,患者依从性不高,样本取材受限[4]。血清肿瘤标志物具有快速、便捷、准确等优点,已成为肿瘤辅助诊断研究的热点。临床常用的肺癌血清标志物主要有癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、神经元特异性烯醇化酶(nueron-specific enolase,NSE)、细胞角蛋白片段19(cytokeratin 19-fragments,CYFRA21-1)等,但是上述指标在其他恶性肿瘤和非肿瘤疾病中也常存在异常表达,用于诊断肺癌的特异性和敏感性均不高[5,6]。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类高度保守的非编码单链RNA,长度约为22个核苷酸,参与多种疾病的发生和进展[7]。研究证实,肺癌患者血清或血浆中miRNA含量变化与肿瘤的发生和发展密切相关,有成为肺癌辅助诊断标志物的潜能[8]。本研究前期对基因表达数据库(gene expression omnibus,GEO)进行筛选,发现miR135a-5p在胃癌、乳腺癌、结直肠癌中均存在异常表达,但是其在肺癌患者中的表达情况尚未见报道。因此,本研究通过检测血清miR135a-5p在肺癌患者中的表达水平。分析其对肺癌及其不同病理分型的辅助诊断价值,旨在为肺癌早期诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年4月至2020年2月在我院住院治疗的115例肺癌住院患者作为肺癌组,男74例,女41年;27～78岁,平均年龄(53.9±8.4)岁;选取同期医院收治的肺部良性疾病患者100例作为良性组,男67例,女33例;年龄23～74岁,平均年龄(52.7±10.5)岁;包括肺炎41例,慢性阻塞性肺疾病30例,间质性肺炎8例,哮喘11例,支气管扩张合并感染6例,肺脓肿4例。同时选择在医院进行健康体检的100例体检者作为对照组,男70例,女30例;年龄19～78岁,平均年龄(53.1±7.4)岁。良性组和对照组均明确排除恶性肿瘤史或恶性肿瘤高危人群。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准:经病理学证实为肺癌;临床资料完整;首次在本院进行治疗;无其他恶性肿瘤。排除标准:严重肝肾功能不全或自身免疫性疾病。

1.3 方法 3组均于清晨空腹状态下采集外周静脉血5 ml,4℃下16 000×g离心10 min,取上清液置于离心管中,-80℃保存待用。取400 μl上清液,采用miRNA血清/血浆提取试剂盒提取血清总RNA,微量分光光度计测量其浓度和纯度。采用美国赛默飞逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。反应体系:miRNA 8 μl、反应缓冲液4 μl、逆转录酶1 μl、逆转录引物1 μl、脱氧核糖核酸和核糖核酸酶抑制剂各1 μl,纯水补足至总反应体系为20 μl。反应体系充分混匀,瞬间离心。反应条件:42℃ 60 min,95℃ 2 min,4℃ 5 min。合成的cDNA于-20℃冰箱保存待用。采用生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成的miR135a-5p以及U6内参、罗氏公司PCR反应混合物(FastStart Universal SYBR Green Ⅰ Master)和美国ABI公司QuantStudio 5 荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR检测。miR135a-5p基因正向引物序列:5′-AGAGTGCAGCTCCGCTCGATTCTACTTCGA-3′,反向序列:5′-TCCTCTGCTCCACTGC-3′。U6基因正向引物序列:5′-GCAAGATAGACACAACATTACG-3′,反向序列:5′-TCGAAGCGTTGAGCAATTTCGC-3′。反应体系:SYBR Green Ⅰ Master 10 μl,cDNA 5 μl,正、反向引物各0.5 μl,纯化水3 μl,充分混匀后瞬时离心。反应条件:94℃ 10 min,60℃ 34 s,72℃ 34 min,共45个循环。每个样本同时设有3个复孔,取平均值。采用相对定量法计算血清miR135a-5p相对含量,以U6作为内参,2-△△Ct作为其相对表达量,△△Ct=实验组(CtmiR135a-5p-CtU6)-对照组(CtmiR135a-5p-CtU6)。血清肿瘤标志物检测:采用罗氏诊断公司的E601电化学发光免疫分析仪及其配套试剂盒检测血清CEA、NSE、CYFRA21-1水平,检测操作严格按照试剂盒说明书。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件,由于血清标志物均不符合正态分布,因此采用中位数(四分位数间距)描述。2组间比较采用Mann-Whitney U检验,3组间比较采用Kruskal-Wallis H检验,之后两两比较采用Dunn-Bonferroni 检验。采用Pearson相关性分析评价血清miR135a-5p含量与CEA、NSE、CYFRA21-1的关系,使用受试者工作曲线(ROC)评价各指标的诊断效能。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组血清miR135a-5p含量和肿瘤标志物水平比较 3组血清miR135a-5p含量和肿瘤标志物水平差异有统计学意义(P<0.05);两两比较:肺癌组血清CEA、NSE、CYFRA21-1、miR135a-5p高于良性组和对照组,良性组血清CEA、NSE、CYFRA21-1又高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);但良性组和对照组血清miR135a-5p含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组血清miR135a-5p含量和肿瘤标志物水平比较 M(P25,P75)

2.2 肺癌患者血清miR135a-5p含量与其临床病理特征的关系 血清miR135a-5p含量与年龄、肿瘤最大径无关(P>0.05),与病理类型、淋巴结转移、临床分期有关(P<0.05)。见表2。

表2 血清miR135a-5p含量与肺癌患者临床病理特征的关系

2.3 肺癌患者血清miR135a-5p含量与其他肿瘤标志的相关性 肺癌患者血清miR135a-5p含量与CEA、NSE、CYFRA21-1均无相关性(r=0.019,P=0.843;r=0.025,P=0.791;r=0.100,P=0.287)。见图1。

图1 肺癌患者血清miR135a-5p含量与CEA、NSE、CYFRA21-1的相关性;A miR135a-5p含量与CEA的相关性;B miR135a-5p含量与NSE的相关性;C miR135a-5p含量与CYFRA21-1的相关性

2.4 血清miR135a-5p与其他肿瘤标志物对肺癌的辅助诊断价值 诊断肺癌、肺鳞癌、肺腺癌、小细胞肺癌曲线下面积(area under curve,AUC)最大的单项指标分别为miR135a-5p(0.785)、CYFRA21-1(0.658)、CYFRA21-1(0.696)、miR135a-5p(0.762),血清miR135a-5p联合其他肿瘤标志物诊断肺癌、肺鳞癌、肺腺癌、小细胞肺癌的AUC为0.849、0.647、0.748、0.773,除肺鳞癌外,联合检测的AUC均高于单项检测。见表3,图2。

图2 血清miR135a-5p和肿瘤标志物诊断肺癌的ROC曲线;A 肺癌组;B 肺鳞癌组;C 肺腺癌组;D 小细胞肺癌组

表3 血清miR135a-5p与其他肿瘤标志物诊断肺癌的效能

3 讨论

发现新的肿瘤标志物是肺癌早期诊断、治疗指导、病情监测的关键。研究发现,miRNA可在血液中长期稳定存在,当发生恶性病变时,某些miRNA含量可发生变化,提示miRNA可能与肿瘤的发生和进展有关[9]。同时,miRNA取材方便,可用于连续监测,是一种理想的肿瘤血清标志物。miR135a-5p属于RNA-135家族成员,其位于第3号染色体(p21.1)[10]。关于miR135a-5p的作用现有研究存在争议,王钦君等[11]认为miR135a-5p在结直肠癌中表达升高,高表达miR135a-5p与淋巴结转移、较差分化程度有关。宋仕军等[12]则证实miR135a-5p在胰腺癌组织中低表达,上调miR135a-5p表达可抑制胰腺癌细胞增殖、迁移和增强化疗敏感性。由此可见,miR135a-5p在不同类型恶性肿瘤中表达和作用并不一样。本研究结果显示,肺癌患者血清miR135a-5p含量明显高于良性组和对照组,提示miR135a-5p在肺癌的发生和进展中可能起到促进作用。殷玉敬等[13]也证实,促癌基因circUBAP2通过作用于靶基因miR-135b-3p,介导肺癌细胞体外增殖和侵袭,抑制miR-135b-3p表达有利于促进肿瘤凋亡,与本研究结果相近。

血液miRNA含量的改变可以间接反映体内病理过程,因此,miRNA可能与肿瘤患者临床病理特征有关。本研究显示,血清miR135a-5p含量与病理类型、淋巴结转移、临床分期有关。在肺癌的3种病理类型中,肺腺癌和小细胞肺癌血清miR135a-5p含量明显升高。可能原因是肺腺癌和小细胞肺癌更容易发生转移,增加了肿瘤细胞将具有促癌作用的miR135a-5p释放至血液的机会,导致血清miR135a-5p表达水平异常升高[14-15]。

在临床分期中,晚期患者血清miR135a-5p有升高的趋势,这是因为肿瘤晚期的患者抑癌基因表达受到抑制,原癌基因表达上调,导致肿瘤组织产生大量miR135a-5p并释放入血。这也提示,监测血清miR135a-5p有利于评估肺癌患者的病情进展。本研究还发现,肺癌患者血清miR135a-5p含量与CEA、NSE、CYFRA21-1等表达均无相关性,与张梦等[16]报道结论一致。黄声凯等[17]报道称miRNA不同于传统肿瘤标志物,其性质更稳定,在诊断疾病中更适用于与传统指标联合检测。

不同病理类型患者ROC曲线分析结果显示,在肺癌、小细胞肺癌中miR135a-5p单独检测的AUC高于其他三种肿瘤标志物,而将血清miR135a-5p联合CEA、NSE、CYFRA21-1可以提高肺癌、肺腺癌、小细胞肺癌的诊断效能,从而为患者赢得早期诊断和治疗的机会。黄俊婷等[18]在研究中也证实,miR135a-5p与糖类抗原125(CA125)联合检测诊断乳腺癌的灵敏度、特异度和阴性预测值均升高,可以作为乳腺癌筛查和病情预测的监测指标。

关于miR-135a-5p作用机制目前研究较少,现有证据提示其可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路,介导上皮细胞间质转化(EMT)促进肿瘤细胞的侵袭和转移[19]。但是本研究同时发现,无论miR-135a-5p单项检测还是联合其他指标,对肺鳞癌的诊断效能均不高。分析原因,可能是肺鳞癌的恶性程度较肺腺癌和小细胞肺癌稍低,在肿瘤发生和进展过程中释放miR-135a-5p等促癌基因偏少[20],使其在早期发病过程中不易检测,诊断效能也偏低。

综上所述,肺癌患者血清miR-135a-5p水平升高,其与其他肿瘤标志物联合检测可提高肺癌及其不同病理类型的诊断效能。但是本研究有以下不足:(1)本研究仅纳入了肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌等3种病理类型肺癌患者,尚无法评价其对其他肺癌病理类型的诊断价值。(2)纳入样本量偏少,尚无法明确miR-135a-5p对肺鳞癌的诊断价值,miR-135a-5p在肺鳞癌中的作用仍需要进一步探讨。