miR-31与头颈部肿瘤关系的研究进展

屈均汶 谭英琼 周方伟

头颈部肿瘤(HNC)是常见的癌症,主要发生在口腔、咽部(包括口咽,鼻咽,下咽)和喉部[1],具有高异质性和高病死率的特点。头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)是其主要病理组织学类型,约占所有HNC的90%。尽管目前对HNSCC临床治疗手段的进步,HNSCC患者的总体5年存活率仍然很低[2]。在生理条件下,miRNAs参与细胞增殖、分化、迁移和凋亡等生物学进程[3]。而恶性肿瘤的微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为21～26个核苷酸的非编码RNA。表达谱研究显示,其发生发展往往伴随着miRNAs的异常表达。miR-31的表达水平在多种恶性肿瘤中上调,并表现出明显的致癌能力[4]。研究表明,miR-31的异常表达在HNSCC的发生发展中起着关键作用,并且与HNSCC早期诊断和预后密切相关[5]。因此,本文综述miR-31在HNC分子发病机制以及作为诊断、预后、治疗等方面生物标记物的最新进展。

1 miRNAs及miRNA-31概述

miRNAs是一类长度为18～26个核苷酸的内源性非编码RNA,最早是在研究线虫神经元分化时发现[6,7]。功能性miRNAs是通过两步转录成熟过程产生的。第一步发生在细胞核中,这一步骤是由一种名为DROSHA的内源性RNaseⅢ和双链RNA结合域蛋白DGCR8促进的。DROSHA复合体切割pri-miRNAs转录本的两条链,形成具有茎环结构的前体分子,其也被称为miRNAs前体(pre-miRNAs)[8]。随后,pre-miRNAs被转运到细胞质中,被Dicer剪切酶和dsRBD蛋白TRBP切割,最终形成一个长度约为22个核苷酸的分子。miRNAs与胞质中Argonaute蛋白结合,形成RNA诱导沉默复合体体(RNA-induced silencing complex,RISC)发挥作用。据推测RISC的5’端会与靶基因的3’非翻译区不完全互补结合,诱导mRNA裂解或抑制mRNA翻译,负向调控基因表达,从而实现在转录后阶段调节基因[9]。研究发现,miRNAs可以作为关键介质参与了多种生物进程的调节,包括细胞生长、增殖、凋亡以及炎性反应等[10]。不仅如此,miRNAs可以通过靶向调控下游基因的表达影响癌基因的增殖、凋亡、分化和迁移,在癌症的发生发展过程中发挥着癌基因或抑癌基因的作用。

miR-31是miRNAs家族的一员,位于人类染色体9p21.3区域[11]。miR-31不仅在胚胎早期发育过程中起到关键作用,还在许多生物发育过程中发挥重要作用[12]。既往研究发现,miR-31在神经干细胞中显著表达[13]。在脊髓损伤后,miR-31不仅可以调控脊髓损伤的炎性反应微环境,还参与了神经干细胞的募集、激活和促进其定向分化为神经元。miR-31在自身免疫性脑脊髓炎小鼠的致病性CD4+T细胞和脾细胞中呈现高表达,而miR-31敲除后显著降低了自身免疫性脑脊髓炎的严重程度[14]。研究表明,miR-31在角质形成细胞的调控中起重要的作用,可通过调控NF-κB、RAS/MAPK、Notch信号通路及部分细胞因子,正向调控角质形成细胞的增殖、分化和细胞活性[15]。在心血管系统方面,miR-31在心肌梗死后心力衰竭患者中的表达水平显著升高,且其表达水平与心功能恶化程度呈正相关[16]。此外,miR-31在多种自身免疫系统疾病中发挥作用。Fan等[17]发现miR-31在系统性红斑狼疮患者T细胞中显著低表达。而miR-31低表达会通过靶向RhoA基因导致T细胞中IL-2的异常表达,进而导致核NF-AT 表达和IL-2启动子活性的改变。在不同类型的肿瘤中,miR-31得到了较为深入的研究。miR-31的异常表达影响某些肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移及对化疗药物敏感性等过程,是预后不良的标志。

2 miR-31与肿瘤概述

研究发现,miR-31在不同肿瘤组织中存在显著的差异表达,发挥着不同的功能。miR-31在肿瘤中的功能取决于所处的微环境及与其他免疫调节因子复杂的相互作用,可能是与PI3K/AKT、RAS/MARK、RB/E2F等信号通路相互作用的结果[18]。miR-31基因位于染色体9p21.3区域,距离已知的肿瘤抑制因子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子(CDKN)2A和CDKN2B位点(编码细胞周期抑制蛋白p15和p16)500 kb[19]。由于它们的接近性,miR-31可能会在各种类型的癌症中与CDKN2A、CDKN2B基因一并缺失。除了基因位点缺失外,EZH2引起的超甲基化等表观遗传修饰也可能会导致miR-31的低表达。

miR-31在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌以及肝细胞癌中表达降低。miR-31可以通过靶向 E2F2 和 CEBPA 将卵巢癌细胞阻滞在G1期,起到抑癌作用。在宫颈癌的相关研究中,miR-31可以促进肿瘤抑制因子基因转录染色质的重构,使得癌细胞生长停滞和迁徙能力减弱[20]。miR-31的过表达并不是引起或加重肿瘤的原因,而是机体对肿瘤的发生发展而自发形成的一种保护机制。而KRAS等致癌分子可以刺激miR-31的启动子并提高其水平。然而另有研究发现,miR-31在肝癌、胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、头颈部鳞癌和食管鳞状细胞癌中过表达,表明其致癌能力[21,22]。miR-31在肝内胆管癌组织中过表达,通过下调 RASA1的表达来增加ERK1/2磷酸化,进而促进胆管癌细胞的增殖。miR-31还与食管鳞癌的分期密切相关[23]。miR-31直接与食管鳞癌细胞中LATS2 mRNA的3’-UTR区结合,抑制LATS2基因的表达,起到促进食管鳞癌的作用。锌缺乏症是食管鳞癌的重要危险因素之一。在极度缺锌的情况下,miR-31参与了食管鳞癌的发生,而下调 miR-31的水平可以有效防止锌缺乏症引起的食管鳞癌[24]。虽然miR-31在大多数类型肺癌中呈现高表达,但在小部分类型肺癌中出现低表达现象,这也说明miRNAs只是肿瘤调控的一种途径。

3 miR-31与头颈部肿瘤概述

HNSCC具有高复发率、高转移率、治疗效果差等特点,尽管目前HNSCC治疗方法包括手术、放疗、化疗以及免疫治疗等多种手段,但患者的预后在过去30年中仍未取得明显改善[25]。miR-31在多种癌症中是一种典型的oncomiR(发挥促癌作用的miRNA)。HNSCC是一类异质性很高的恶性肿瘤,但总体而言,miR-31在HNSCC中高表达。而这种异常上调被推测与HNSCC中EGFR-AKT-CEBP/β信号通路的激活有关[26]。过表达的miR-31可通过多种机制促进HNSCC细胞的增殖和侵袭性。miR-31通过靶向HIF抑制因子(factor inhibiting HIF,FIH)改变缺氧诱导因子(HIF)途径,触发血管内皮生长因子(VEGF)的表达,从而促进常氧条件下HNSCC的发展。此外,miR-31降低ARID1A蛋白(染色质重塑SWI/SNF复合体的成员)的表达,促进HNSCC肿瘤干性和侵袭性[27]。ARID1A是染色体重塑复合物SWI/SNF家族BAF亚基中的一个成员,其作为抑癌基因在肿瘤的形成、增殖、侵袭迁移、细胞周期以及DNA损伤的修复等方面发挥重要作用。临床分析进一步证实外周血miR-31可作为区分HNSCC与健康对照组的生物标志物,并与HNSCC患者的肿瘤分化,转移和分期等预后指标密切相关[5]。基于顺铂的化学放射疗法(CCRT)可较好地控制局部晚期头颈部鳞状细胞癌(LAHNSCC)患者肿瘤复发和转移,最近一项临床研究报道miR-31可作为LAHNSCC 患者的CCRT改善反应率的生物标记物[28]。

3.1 miR-31与鼻咽癌 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种与Epstein-Barr病毒(EBV)感染相关的上皮恶性肿瘤。在全球范围内,NPC属于罕见的头颈部肿瘤,平均年发病率为<1/100 000[29]。然而在我国华南地区以及东南亚地区的发病率很高,局部复发和远处转移是患者的主要死亡原因。鼻咽癌的发生与上皮细胞一系列异常的基因改变有关。Qiang等[5]发现人鼻咽癌CNE-2细胞系中miR-31的表达明显高于人正常口腔角质形成细胞(NHOK),在转染miR-31后,细胞增殖和侵袭能力显著增强。然而亦有一些研究表明miR-31在NPC患者中下调,并发挥抑癌作用。Cheung等[30]检测了NPC细胞系以及NPC患者原发肿瘤病灶中的miR-31水平,发现其明显下调。

进一步机制研究表明,miR-31可靶向微小染色体维持蛋白2(MCM2)和FIH1基因,抑制NPC细胞的生长和迁移。与其他HNSCC不同,FIH1在鼻咽癌中并非通过经典的HIF途径发挥作用。下调的miR-31可以促进NPC细胞中FIH1的表达,但并未改变其靶蛋白HIF1的表达,而是抑制了p53/p21轴。而MCM2是真核细胞DNA复制启动和延伸的必需因子之一,MCM2蛋白失调与多种肿瘤的发生密切相关[31]。一些学者探讨了miR-31在NPC中低表达的具体分子机制。染色体9p21.3区域的缺失是NPC患者中经常观察到的基因改变,而该区域包含了细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂2A(CDKN2A)和miR-31基因。CDKN2A直接参与细胞周期的调控,负有调节细胞增殖及分裂的功能。CDKN2A功能丧失会导致细胞恶性增殖从而诱发肿瘤[32]。此外,miR-31的表达受其宿主基因LOC554202的启动子调控,LOC554202的5’CpG岛的超甲基化可导致miR-31的转录抑制。而在NPC细胞中经常出现LOC554202基因5’CpG岛的纯合缺失和超甲基化[33]。这些原因可能解释了NPC患者中miR-31表达的异质性。

miR-31不仅可以作为临床上治疗 NPC的新型靶标,并且具有作为NPC早期诊断的非侵入性生物标志物的潜力。一项临床研究发现NPC患者外周血的miR-31较健康对照明显下降,并且miR-31水平与肿瘤分期以及局部淋巴结转移密切相关[34]。放射治疗是NPC的一线治疗,放射抗性是影响患者治疗效果和预后的主要原因之一。然而目前尚不清楚NPC产生放射抗性的分子机制。Guo等[35]比较分析了抗辐射的NPC CNE2-R细胞系和放射敏感性CNE2细胞系之间的差异表达microRNA,发现miR-31明显下调。这表明miR-31可能参与了NPC抗辐射性的调控。miR-31下调与NPC的放射抗性有关,蛋白互作网络(PPI)分析表明原癌基因c-Jun是PPI网络中的核心枢纽基因。c-Jun是转录因子激活蛋白-1(AP-1)的重要组成部分,通过调节下游靶基因,参与细胞增殖、凋亡以及侵袭转移等生物学行为。因此,下调的miR-31可能通过靶向c-Jun增强 NPC放射抗性,这将为提高NPC放射敏感性提供新的治疗靶点。亦有学者考虑上调体内miR-31来治疗NPC。Wu等[36]发明了一种非病毒微环载体,构建了一个新型的EBNA1特异性miRNA表达系统:minicircle-oriP-miR-31,mc-oriP-miR-31处理可抑制NPC细胞的增殖和迁移。

3.2 miR-31与口腔癌 在HNSCC中,口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常见的肿瘤类型,其5年生存率仅为50%。口腔癌可以发生于口腔的任意部位,大多数发生于舌部和口腔底部。已有多篇文献报道miR-31在OSCC中上调,其可以通过调控多个靶基因的转录促进OSCC的发生发展。例如,Jung等[37]发现miR-31靶向调控Wnt信号通路中的关键下游效应分子cyclin D1和C-myc,而cyclin D1和c-MYC是参与细胞周期和增殖调控的经典原癌基因,在肿瘤细胞的生长、侵袭、迁移、凋亡等方面发挥重要作用。miR-31亦可抑制Hippo通路中关键激酶LAST2表达促进OSCC 细胞增殖和转移[38]。LATS2 通过磷酸化YAP蛋白从而抑制OSCC细胞侵袭,而LATS2 启动子甲基化则会促进OSCC 发展。此外,Lai等[39]发现miR-31通过调节过氧化酶体β氧化关键酶ACOX1,改变细胞脂质代谢组,增强了肿瘤细胞的运动及变形能力,这促进了OSCC转移和侵袭的功能。基因组不稳定也是OSCC发生的原因之一。Tseng等[40]在人类OSCC组织中发现了miR-31与Ku80的反向表达谱。特别是在化学致癌物诱导的OSCC,Ku80的下调和口腔鳞状上皮修复活性的降低明显相关。而Ku80是一种基因修复蛋白,参与DNA双链断裂修复,在维持基因组完整性中起重要作用。肿瘤细胞的特征之一在于细胞能量代谢异常。最近一项研究表明,miR-31介导OSCC细胞的沉默信息调节因子3(SIRT3)的转录后调控[41]。miR-31-SIRT3轴失调破坏了线粒体膜电位和结构完整性,也有助于氧化应激的产生;另外,miR-31将肿瘤细胞从有氧代谢转换为糖酵解代谢,这些证据表明miR-31可通过影响肿瘤细胞的能量代谢从而促进OSCC发展。

miR-31的异常表达也发生在口腔癌前病变中。在口腔白斑(oral leukoplakia,OLK)患者的病变黏膜中发现miR-31明显上调。有研究显示miR-31可通过影响机体的免疫应答功能,在口腔白斑恶性转化为OSCC的过程中起着至关重要的调节作用[42]。

患者体液中的miR-31可以作为口腔癌早期诊断以及术后随访的生物标志物。Lu等[43]发现在OSCC患者和健康对照之间差异miRNA时,仅血清miR-31水平存在显著差异。而OSCC患者在切除肿瘤病灶后,miR-31的表达水平恢复到基线水平。内源唾液miRNA的降解速度比外周血中miRNA慢得多,并且能够更为准确地反映原发肿瘤中的miRNA表达谱。近些年来,越来越多的学者开始探索唾液miRNA作为早期诊断OSCC的生物标志物。Momen-Heravi等[44]发现口腔癌患者唾液中miR-31的表达显著增加,并认为它是口腔癌的特异性诊断标记物。此外,miR-31与OSCC患者的预后也密切相关。Siow等[45]报道高表达的miR-31水平与OSCC患者更差的临床分期以及病理类型有关。顺铂(DDP)是OSCC患者的一线化疗药物,而OSCC患者对DDP耐药性仍然是临床上亟需解决的难题。miR-31可以负向调控KN基序和锚蛋白重复结构域1(KANK1),从而导致OSCC细胞对DDP敏感性降低并抑制其凋亡。

3.3 miR-31与喉癌 喉癌是我国北方最常见的头颈部恶性肿瘤,超过95%的喉癌组织学类型为鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)[46]。Lucas等[47]发现LSCC患者外周血miR-31表达明显上调,ROC曲线分析表明miR-31对LSCC诊断具有高敏感性和特异性。因此,miR-31可被视为LSCC早期诊断的非侵入性生物标记物。然而,Yang等[48]却发现LSCC组织中miR-31的表达水平下调,而miR-31的过表达可抑制LSCC细胞的生长和侵袭机制,表明miR-31下调可促进RhoA的表达。而Rho蛋白是一种具有GTP酶活性的小分子蛋白,可调节细胞周期、细胞骨架活动、细胞迁移等多种生物学活动,在癌症的进展中起重要作用。miR-31不仅在LSCC的早期诊断中发挥作用,亦认为miR-31可作为LSCC对化疗药物敏感性的标志物。紫杉醇是一种广泛应用于晚期LSCC患者的化疗药物。然而,临床上发现有20%～40%的晚期LSCC患者对紫杉醇治疗无反应;利用紫杉醇处理喉癌细胞系Hep2,发现miR-31的表达明显上调,且增加倍数是所有发生表达变化的miRNAs中最高的[49]。这为预测LSCC患者对紫杉醇敏感性和耐药性提供了良好的生物标志物。然而,miR-31对LSCC作用尚存在矛盾之处,这也体现出LSCC发病机制的复杂性,仍需要进一步研究miR-31在LSCC中的作用。

3.4 miR-31与甲状腺癌 甲状腺癌是较为常见的头颈部恶性肿瘤之一,也是最常见的内分泌恶性肿瘤。研究表明包括miRNAs在内的表观遗传调修饰改变会促进甲状腺癌的发展,深入了解这些变化将会有助于其诊断、治疗和预后。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)是甲状腺癌中最常见的病理类型。Wu等[50]发现相较于正常组织,PTC患者的癌组织样本中miR-31 显著下调。miR-31下调显著增加了甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而进一步的荧光素酶报告基因检测显示RNA结合蛋白Hu R是miR-31的靶基因。Hu R是一种研究较为清楚的反式作用因子,其通过结合靶mRNA 3’-UTR中富含AU的元件,参与mRNA的稳定、剪接和翻译调控等步骤。许多重要的致癌因子mRNA已被鉴定为Hu R的下游靶点。因此,Hu R表达增加或核浆分布异常与肿瘤的不良转化密切相关。类似的是Wang等[51]也发现PTC中miR-31下调,且与患者的总生存时间相关。过表达miR-31可以通过直接靶向SOX11基因,负向调节ERK 、Akt信号通路和上皮间质转化,从而抑制 PTC 细胞增殖、侵袭和迁移能力。

转录因子SOX11是SOX基因家族中的一个特定转录因子,其编码的蛋白质能与高迁移率组蛋白盒(high mobility group box,HMG-box)特定编码区特异性结合并发挥转录调控作用。此外,SOX11过表达与许多基因的异常组蛋白修饰和DNA甲基化密切相关。近年发现SOX11在食管癌、乳腺癌、淋巴瘤等恶性肿瘤中异常表达。尽管乳头状甲状腺癌(PTC)患者的预后非常好,5年生存率>95%,然而超过 25% 的 PTC 患者在长期随访期间出现复发。组织病理学分期也不易识别一部分患者具有以局部复发和(或)远处转移的侵袭性特征。因此,识别具有侵袭性表型的 PTC 患者可能有助于通过优化手术、辅助治疗和长期随访来指导临床管理。有学者报道与非侵袭性 PTC 相比,侵袭性 PTC 中的miR-31升高,并且血清外泌体中miR-31可作为识别侵袭性 PTC的预测诊断标志物[52]。此外,Suresh等[53]通过分析美国PTC患者癌组织样品miRNA 表达谱,表明miR-31在PTC中明显上调。这些矛盾的结果表明PTC可能具有人种和地域差异,未来仍需要深入探究miR-31在PTC中的作用机制。

甲状腺髓样癌 (medullary thyroid carcinoma,MTC)是一种比较罕见的甲状腺癌,占所有甲状腺癌的 3%～5%,其恶性程度较高,对患者健康危害较大。然而,目前对 MTC 的发病机制仍知之甚少。研究发现,miR-31表达在 MTC 中显著下调,并且表现为低 miR-31水平患者的预后较差[54]。miR-31可以负向调控RAS信号通路,在 MTC 的肿瘤发生中起关键作用。RAS 蛋白在调节细胞生长、增殖、凋亡、分化、黏附、迁移、和细胞骨架重排等多种信号通路中起着至关重要的作用。大多数甲状腺癌是由激活的 RAS/ERK 促进有丝分裂信号通路引起。因此,靶向miR-31或许是治疗甲状腺癌行之有效的方法。

3.5 miR-31与食管癌 食管癌是我国发病率和病死率均较高的肿瘤之一,而食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是我国食管癌患者的主要病理类型。颈段食管癌是指肿瘤上缘位于颈段食管的食管癌,由于解剖结构复杂,被认为是一种治疗十分棘手的头颈部肿瘤。尽管近年来在手术、放疗和化疗等方面取得了一定进展,但 ESCC患者的总体生存前景仍不容乐观。因此,迫切需要进一步阐明ESCC的分子发病机制,进而提供新的治疗策略。有研究发现miR-31在ESCC中过度表达,通过TCGA数据库进行生物信息学分析,miR-31与ESCC患者的总生存期相关[55]。血清 miR-31 水平高的患者在生存率和复发率等预后指标方面较差。此外,相同病理阶段的食管癌患者接受相同的手术治疗,可能会有不同的预后。有学者调查了可能导致预后差异的miRNA表达谱,结果显示,与预后良好的患者相比,预后不良患者miR-31水平显著上调;进一步实验表明miR-31 靶向3个抑癌基因,包括 EMP1、KSR2和 RGS4,从而在ESCC中发挥致癌作用[56]。研究者通过对ESCC大鼠模型进行转录组学、基因组和代谢组学测序分析,揭示miR-31敲除能够抑制促进ESCC 发生的许多分子[57]。其中脯氨酸羟化酶3(EGLN3)是作为 miR-31 的直接作用靶标。miR-31过表达导致EGLN3/NF-κB调控的炎症通路激活,LNA-antimiR-31给药抑制了 ESCC 发展。EGLN3属于脯氨酰羟化酶家族,能够将HIF-α蛋白中特定的脯氨酸残基羟基化,调节HIF氧感知通路。EGLN3也是转录因子NF-κB的负调节因子,从而参与调控恶性肿瘤细胞许多重要信号转导通路。

3.6 miR-31与唾液腺癌 唾液腺癌(salivary gland carcinoma,SGC)是一种罕见的头颈部恶性肿瘤[58]。SGC的病理类型包括黏液表皮样癌、腺样囊性癌、涎腺分泌癌、腺泡细胞癌、多形性腺瘤恶变、唾液腺导管癌、未分类腺癌等。大多数唾液腺癌无明显症状,可表现为无痛、渐进性生长的包块。肿瘤生长较快时,可出现包快疼痛、功能性神经功能受损(如麻木、面瘫)等。目前针对SGC的治疗策略是肿瘤切除+辅助放疗,然而患者的5年生存率仅为20%[57]。通过揭示 SGC 的肿瘤特征,例如miRNAs表达谱,可以精确地实现患者的个体化治疗。Cinpolat等[59]分析20例唾液腺肿瘤患者(良性肿瘤16例,恶性肿瘤4例),结果发现SGC患者血清中的miR-31较良性肿瘤组患者明显升高,而唾液中的miR-31水平则无明显差异。因此,血清中miR-31可能是SGC诊断的潜在生物标志物。然而miR-31在促进SGC发生发展的分子机制仍不明确,需要更多的研究来探索miR-31在SGC中的作用。

随着新一代高通量测序、基因芯片技术和生物信息学技术的广泛应用,学者们对miRNAs有了更加全面的认识。miR-31失调影响肿瘤细胞多种生物学活动,在HNC的发生发展中起关键作用。miR-31与HNC患者的肿瘤进展、治疗反应、预后等方面密切相关。外周血及唾液等体液中的miR-31性质稳定,因此也很可能成为临床上HNC早期诊断、疾病监测以及预测预后的生物标记物。在治疗方面,未来可开发基于miRNAs的药物与一线药物联合,对miR-31表达进行外源调节从而靶向治疗HNC,以改善患者预后。