普拉克索下调TXNIP表达对氧糖剥夺/再灌注心肌细胞p38/JNK通路的作用研究

高伟 李慧颖 李丹

缺血性心脏病是常见的心血管疾病,它可导致心肌缺血缺氧,最终导致心肌细胞死亡[1]。心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是缺血性心脏病的常见临床和病理状态,尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)后。心肌I/R损伤是AMI治疗失败和病情恶化的主要原因之一[2]。普拉克索是一种选择性多巴胺D2受体激动剂,具有多巴胺能活性、抗氧化活性和神经保护作用[3]。先前的研究表明,普拉克索对心肌I/R损伤具有保护作用,其通过促进心肌细胞自噬和活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生,改善缺氧/复氧心肌细胞存活率,降低乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性[4],然而,作用机制尚未完全明确。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是一种促氧化蛋白,对硫氧还蛋白的活性及其抗氧化功能具有负性调节作用[5]。已有研究表明,心脏特异性TXNIP过表达通过诱导ROS产生和心肌细胞凋亡,促进心肌I/R损伤小鼠心功能不全,而心脏特异性TXNIP基因敲除则会减轻I/R诱导的心肌细胞损伤,改善心功能[6]。另有研究表明,敲低TXNIP通过抑制p38和C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinse,JNK)磷酸化减轻氧糖剥夺所致的神经元细胞氧化应激损伤,从而在缺血性卒中中发挥保护作用[7]。本研究旨在探究普拉克索对氧糖剥夺/再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)心肌细胞的作用及机制是否与TXNIP和p38/JNK通路相关,以期为明确普拉克索在心肌I/R损伤中的药理作用机制及开发新的心肌I/R损伤治疗药物提供新的科学资料。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠心肌细胞H9c2购自中国科学院细胞库;普拉克索购自美国MedChemExpress;Lipofectamine 2000转染试剂购自美国ThermoFisher Scientific;TXNIP 过表达载体(oe-TXNIP)及其阴性对照(oe-NC)购自苏州泓迅生物科技股份有限公司;CCK-8试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(比色法)、肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)测定试剂盒(免疫抑制法)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)和总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1 法)购自南京建成生物工程研究所;Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧(ROS)检测试剂盒和Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司;TXNIP和GAPDH抗体购自英国Abcam公司;p-p38、p38、p-JNK和JNK抗体购自美国Cell Signaling Technology;AceQ qPCR SYBR Green Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 细胞培养及OGD/R处理 H9c2细胞用含10% FBS的DMEM培养基培养,条件为37℃、5%CO2和95%空气。待细胞密度达到80%～90%时,胰酶液消化细胞,按照需求进行传代培养或者是铺板操作。参考文献[8],对H9c2细胞进行OGD/R处理。首先将H9c2细胞培养基更换为无糖DMEM培养基,随后将细胞置于37℃、94% N2、5% CO2、1%O2培养箱内培养6 h。将细胞培养基更换为含10% FBS的DMEM培养基,正常培养6 h。收集细胞,进行后续实验操作。

1.3 普拉克索使用浓度检测 将对数期生长的H9c2细胞接种于96孔板,每孔1×104个细胞。细胞继续培养24 h后,将细胞随机分为0 μmol/L组、20 μmol/L组、40 μmol/L组、80 μmol/L组、100 μmol/L组、120 μmol/L组和140 μmol/L组,按照分组,向细胞中添加不同浓度普拉克索。另设空白组(无细胞和试剂)用以读值调零。细胞继续培养24 h后,按照CCK-8试剂盒说明书所示检测各组细胞光密度(OD)值。细胞活力(%)=(给药组OD值-空白组OD值)/(0 μmol/L组OD值-空白组OD值)×100%。

1.4 细胞分组及给药处理 取对数期生长的H9c2细胞接种于6孔板,每孔1×106个细胞。细胞继续培养24 h后,将细胞随机分为对照组、OGD/R组、Pra-50 μmol/L组(添加普拉克索50 μmol/L)和Pra-100 μmol/L组(添加普拉克索100 μmol/L),按照分组,添加普拉克索,而对照组和OGD/R组添加等量溶剂。细胞继续培养24 h后,除对照组外,其余组均进行OGD/R处理。收集细胞,进行后续实验操作。

1.5 细胞转染 取对数期生长的H9c2细胞接种于6孔板,1×106个/孔。细胞继续培养24 h后,将细胞随机分为OGD/R组(不进行转染操作)、Pra-100 μmol/L组(添加100 μmol/L普拉克索但不进行转染操作)、Pra-100 μmol/L+oe-NC组(添加100 μmol/L 普拉克索并转染oe-NC)和Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP组(添加100 μmol/L普拉克索并转染oe-TXNIP)。按照分组,根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行细胞转染,细胞继续培养48 h。添加普拉克索处理细胞24 h后,对各组细胞进行OGD/R处理。收集细胞,进行后续实验操作。

1.6 CCK-8检测细胞活力 取对数期生长的H9c2细胞接种于96孔板,每孔1×104个细胞。按照1.4和1.5所示对细胞进行分组和处理。此外,另设空白组(无细胞和试剂)用以读值调零。根据CCK-8试剂盒说明书所示检测各组细胞光密度(OD)值。细胞活力(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%或者是细胞活力(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(OGD/R组OD值-空白组OD值)×100%。

1.7 试剂盒检测LDH和CK-MB活性、MDA和SOD含量 收集H9c2细胞及其培养上清液,按照试剂盒说明书所示检测细胞或培养上清液中LDH和CK-MB活性、MDA和SOD含量。

1.8 流式细胞术检测ROS产生 弃去H9c2细胞培养上清液,PBS清洗后,向细胞中加入浓度为10 μmol/L的DCFH-DA工作液,37℃培养箱内避光孵育30 min后,用无血清DMEM培养基清洗细胞后,收集细胞,上流式细胞仪检测ROS产生。

1.9 流式细胞术检测细胞凋亡 收集H9c2细胞,预冷PBS洗涤细胞后重新收集细胞。向细胞中加入1×结合缓冲液将细胞密度调整为1×106个/ml。取100 μl 细胞悬液,向细胞中添加5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI 染色液,轻轻混匀,室温条件下避光孵育15 min。加入400 μl 1×结合缓冲液,充分混匀后,立即用流式细胞仪检测。

1.10 Western blot检测TXNIP、p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白表达 收集H9c2细胞,裂解液裂解细胞。收集上清液并测定其蛋白浓度。各组取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳以及转膜操作。5%脱脂奶粉室温条件下封闭3 h,加入TXNIP(1∶1 000)、p-p38(1∶2 000)、p38(1∶1 000)、p-JNK(1∶2 000)、JNK(1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000)抗体,4℃条件下孵育过夜。加入二抗(1∶5 000),室温条件下孵育1 h。凝胶成像系统检测蛋白条带,Image J软件分析各蛋白条带的灰度值。

1.11 qRT-PCR检测TXNIP mRNA表达 收集H9c2细胞,Trizol试剂提取细胞总RNA。将RNA反转录为cDNA,并按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix说明书所示,进行后续实验。反应程序:95℃、5 min;95℃、10 s,60℃、30 s,40个循环;95℃、15 s,60℃、60 s,95℃、15 s。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt法计算TXNIP mRNA表达。TXNIP上游引物:5’-AAGCGT

TGAGTAGTACAGATGAG-3’; TXNIP下游引物:5’-GGTATGGCGTGGCAAGAGTC-3’;GAPDH上游引物:5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’; GAPDH下游引物:5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’。

2 结果

2.1 普拉克索对OGD/R心肌细胞活力、氧化应激和凋亡的影响

2.1.1 与0 μmol/L组比较,120 μmol/L组和140 μmol/L组心肌细胞活力降低(P<0.05),而20 μmol/L组、40 μmol/L组、80 μmol/L组和100 μmol/L组心肌细胞活力差异无统计学意义(P>0.05),因此,后续实验中普拉克索的最大安全浓度为100 μmol/L。见表1。

表1 CCK-8检测不同浓度普拉克索处理下的细胞活力 %,

2.1.2 与对照组比较,OGD/R组心肌细胞活力降低,心肌细胞ROS产生和细胞凋亡率升高(P<0.05);与OGD/R组相比,Pra-50 μmol/L组和Pra-100 μmol/L组心肌细胞活力升高,心肌细胞ROS产生和细胞凋亡率降低(P<0.05),且普拉克索的作用呈剂量依赖性。见表2,图1。

图1 流式细胞术检测细胞ROS产生和心肌细胞凋亡;A 流式细胞术检测细胞ROS产生;B流式细胞术检测普拉克索对OGD/R心肌细胞凋亡的影响

表2 普拉克索对OGD/R心肌细胞损伤的影响 %,

2.2 普拉克索对OGD/R心肌细胞TXNIP表达和p38/JNK通路的影响 与对照组相比,OGD/R组心肌细胞TXNIP、p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达升高(P<0.05);与OGD/R组相比,Pra-50 μmol/L组和Pra-100 μmol/L组心肌细胞TXNIP、p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达降低(P<0.05),且普拉克索的作用呈剂量依赖性。见表3,图2。

图2 Western blot检测普拉克索对OGD/R心肌细胞TXNIP表达和p38/JNK通路的影响

表3 Western blot检测普拉克索对OGD/R心肌细胞TXNIP表达和p38/JNK通路的影响

2.3 过表达TXNIP逆转普拉克索对OGD/R心肌细胞活力、氧化应激和凋亡的影响 与OGD/R组相比,Pra-100 μmol/L组心肌细胞中TXNIP mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),细胞活力升高,心肌细胞ROS产生和细胞凋亡率降低(P<0.05);与Pra-100 μmol/L组相比,Pra-100 μmol/L+oe-NC组心肌细胞中TXNIP mRNA和蛋白表达、细胞活力、心肌细胞ROS产生和细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);与Pra-100 μmol/L+oe-NC组相比,Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP组心肌细胞中TXNIP mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),细胞活力降低,心肌细胞ROS产生和细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表4、5,图3、4。

图3 过表达TXNIP逆转普拉克索对OGD/R心肌细胞氧化应激和凋亡的影响;A 流式细胞术检测细胞ROS产生;B 流式细胞术检测普拉克索对OGD/R心肌细胞凋亡的影响

图4 Western blot检测细胞中TXNIP蛋白表达

表4 Western blot检测普拉克索对OGD/R心肌细胞TXNIP表达和p38/JNK通路的影响

表5 过表达TXNIP逆转普拉克索对OGD/R心肌细胞损伤的影响

2.4 过表达TXNIP逆转普拉克索对OGD/R心肌细胞p38/JNK通路的影响 与OGD/R组相比,Pra-100 μmol/L组心肌细胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达降低(P<0.05);与Pra-100 μmol/L组相比,Pra-100 μmol/L+oe-NC组心肌细胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与Pra-100 μmol/L+oe-NC组相比,Pra-100 μmol/L+oe-TXNIP组心肌细胞中p-p38/p38和p-JNK/JNK蛋白表达升高(P<0.05)。见图5,表6。

图5 Western blot检测过表达TXNIP逆转普拉克索对OGD/R心肌细胞p38/JNK通路的影响

表6 Western blot检测过表达TXNIP逆转普拉克索对OGD/R心肌细胞p38/JNK通路的影响

3 讨论

PCI术后缺血心肌组织恢复了血流供应,挽救了濒临死亡的心肌细胞,大大降低了心肌梗死患者的致残率和死亡率[9]。然而,PCI治疗并不能减轻或恢复心肌细胞的缺血性损伤,反而加重了部分AMI患者的心肌损伤程度[10]。如何预防和减轻AMI的I/R损伤已成为亟待解决的问题。

LDH和CK-MB在心肌细胞中有组成性表达,在正常生理状态下不能穿透细胞膜;但当细胞受损或死亡时,它们会被释放出来[11]。因此,培养液中LDH和CK-MB的活性代表了OGD/R对H9c2细胞损伤的程度。已有研究表明,普拉克索在吗啡诱导的小鼠不良心室重构中发挥保护作用[12]。此外,普拉克索对心肌I/R损伤也具有保护作用[4]。结果表明,普拉克索可抑制OGD/R诱导的心肌细胞损伤。心肌I/R损伤包括一系列复杂的病理过程,包括炎性反应、钙超载、补体激活、细胞自噬和凋亡[13]。研究证实,氧化应激和细胞凋亡在这一病理过程中起着重要作用。抑制I/R损伤后的氧化应激水平和心肌细胞凋亡将是防治AMI I/R所致心肌损伤的重要手段[14]。目前的证据显示,普拉克索通过其抗凋亡和抗氧化作用在创伤性脑损伤大鼠中发挥神经保护作用[15]。本研究结果显示,普拉克索可抑制OGD/R诱导的心肌细胞氧化应激和细胞凋亡。

TXNIP作为细胞氧化还原平衡的关键因子,是氧化应激与炎症损伤之间重要的桥梁[16]。TXNIP是组织I/R损伤过程的重要参与者。靶向TXNIP是保护大脑免受缺血性脑损伤的潜在治疗策略[17];TXNIP还参与肠I/R损伤过程,二甲双胍通过抑制TXNIP表达降低氧化应激和炎性反应,从而改善小鼠肠I/R损伤[18];此外,TXNIP还参与心肌I/R损伤过程。刺芒柄花素通过抑制TXNIP介导的通路,减轻心功能不全、梗死面积、心脏标志物释放、ROS产生和炎性反应,从而改善大鼠心肌I/R损伤[19]。本研究结果显示,普拉克索通过抑制TXNIP表达在OGD/R诱导的心肌细胞损伤中发挥保护作用。

研究表明,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号的持续激活在调节细胞增殖、促凋亡蛋白表达和ROS产生中起着至关重要的作用[20]。p38和JNK是MAPK家族的成员[20],参与脊髓I/R损伤过程,抑制p38/JNK通路可减轻大鼠脊髓I/R损伤[21]。另有证据显示,OGD/R处理可诱导神经元细胞中p38/JNK通路的激活,靶向抑制p38/JNK通路促进细胞存活并抑制细胞凋亡,从而抑制神经元细胞OGD/R损伤[22]。此外,p38/JNK通路还参与心肌I/R损伤过程。抑制p38/JNK通路可抑制氧化应激和细胞凋亡,从而改善H9c2细胞I/R损伤[23]。目前,已有证据显示,TXNIP可介导p38/JNK通路的活化。TXNIP通过激活p38/JNK通路促进细胞凋亡和氧化应激,从而促进OGD/R诱导的肝细胞损伤[24]。本研究结果显示,普拉克索通过抑制TXNIP表达抑制OGD/R诱导的心肌细胞中p38/JNK通路激活。

综上所述,本研究结果表明,普拉克索可能通过下调TXNIP表达抑制OGD/R诱导的心肌细胞中p38/JNK通路激活,从而抑制细胞氧化应激和凋亡,在OGD/R诱导的心肌细胞损伤中发挥保护作用。该研究结果为明确普拉克索在心肌I/R损伤中的作用及开发新的治疗药物提供了新的科学资料。