基于HS-GC/MS的化橘红挥发性成分特征研究

黄洁文，王艳慧，杨丽莹，黄绮韵，吴舒楹，秦群英

（广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663）

化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis（L.）Osbeck 的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，具有理气宽中、燥湿化痰的功效。道地化橘红是《广东省岭南中药材保护条例》立法保护的8种中药材之首，有“南方人参”之称和“一片值一金”的说法，因治痰有奇效成为明清时代的宫廷贡品，主产于广东省化州市，产地根据药材表面茸毛疏密、长短，分为正毛、副毛、光果等不同类别，业内普遍认为正毛化橘红质量最优，副毛化橘红次之，光果化橘红再次之。茸毛疏密、长短多根据个人经验进行鉴别，目前没有具体的量化标准，具有较大主观性，在外观特征被破坏或不明显的时候就更加难以判断。

现有研究大多集中于比较化州柚和柚两种不同基原化橘红的质量差异[1-8]，鲜有关于基原同为化州柚的正毛、副毛、光果化橘红质量差异的研究报道。本课题组在前期研究中试图从主要药效部位黄酮类成分中寻找能够区分不同类别化橘红的内在质量特征，发现正毛与副毛、光果之间有较明显差异，但副毛与光果之间没有明确界限，仅靠黄酮类成分还难以将3个类别化橘红区分开来。

挥发油是化橘红主要药效部位之一，现有研究主要采用GC 或GC-MS 法对化橘红挥发性成分进行分析，研究化橘红挥发性成分组成[9-10]，比较不同类别[11-12]、不同产地[13]、不同采收时间[14]，以及化州柚花果叶等不同部位[15]的挥发性成分差异。常用的中药材挥发性成分检测的样品前处理方法有水蒸汽蒸馏法和溶剂提取法，前者普遍存在重复性差、操作繁琐耗时的问题，而且样品经过长时间蒸馏，挥发性成分的种类和浓度可能会发生变化，不能准确反映样品原来的物质组成，而后者则受提取溶剂性质影响，也比较局限。顶空进样技术可实现样品固态进样，通过加热使挥发性组分从样品中挥发出来，然后直接进样分析，该方法能够简化样品前处理，方法快速、重复性好，能够相对准确地反映样品挥发性成分组成。

本研究首次采用顶空-气相色谱/质谱联用技术（HS-GC/MS）对化橘红药材挥发性成分进行研究，探索不同类别化橘红药材的挥发性成分组成特点，对化橘红质量评价和等级标准建立具有重要意义。

1 材料

1.1 样品采集及处理

2020 年4 月至5 月在化州市化州中药厂化橘红GAP种植基地收集了36批化州柚鲜果样品，其中正毛、副毛、光果各12批，经广州市香雪制药股份有限公司王艳慧高级工程师鉴定均为芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’。将化州柚鲜果置沸水中杀青2 min，取出沥干水，除去果瓤和部分中果皮，于60 ℃烘干，即得化橘红药材样品，备用。样品信息见表1所示。

1.2 仪器

7890A-7000B型三重串联四级杆气质色谱仪（美国Agilent公司，GC-QQQ Mass Hunter工作站）；TRI PLUS 300 顶空进样器（美国Thermo 公司）；MS204S型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；RHP-250 型高速粉碎机（浙江永康市荣浩工贸有限公司）。

1.3 试药

柠檬烯对照品（批号100470-201503）、芳樟醇（批号111503-201603）、β-丁香烯（批号111819-201703）均购自中国食品药品检定研究院；β-月桂烯对照品（批号BCBW0611）、γ-松油烯（批号BCBZ1985）、α-松油烯（批号BCBW4489）、间伞花烃（批号BCBT7572）均购自美国Sigama 公司；α-蒎烯（批号G1809164）、β-蒎烯（批号F1912161）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2 方法

2.1 HS-GC/MS条件

顶空进样条件：顶空样品平衡温度95 ℃，平衡时间40 min，定量环温度105 ℃，传输管温度115 ℃，中速振摇，进样体积1 mL。

GC条件：色谱柱Agilent HP-INNOWAX（30 m×250 μm×0.15 μm）；柱温为程序升温：初始温度35 ℃，保持3 min；以5 ℃/min 的速率升温至80 ℃；再以20 ℃/min 的速率升温至100 ℃；再以5 ℃/min的速率升温至160 ℃；最后以20 ℃/min 的速率升温至240 ℃。进样口温度115 ℃；分流比300∶1；载气：高纯氦气（纯度＞99.999%）；流速0.6 mL/min。

MS 条件：电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；溶剂延迟3 min；全扫描模式，质量扫描范围m/z20～350。

2.2 供试品制备

化橘红药材样品粉碎，过二号筛，取粉末0.50 g，精密称定，置20 mL顶空进样瓶中，即刻加盖密封，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取编号S6 化橘红样品粉末，按“2.2”项下方法制备6份供试品，按“2.1”项下分析条件进样检测，记录各共有峰的保留时间及峰面积。结果各共有峰的相对保留时间RSD＜0.08%，相对峰面积RSD＜1.64%。表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取编号S6 化橘红样品，按“2.2”项下方法平行制备6 份供试品，按“2.1”项下分析条件进行检测，记录各共有峰的保留时间及峰面积。结果各共有峰的相对保留时间RSD＜0.06%，相对峰面积RSD＜2.57%。表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取编号S6 化橘红样品粉末，按“2.2”项下方法制备6 份供试品，分别在0、6、12、18、24、48 h 进样，按“2.1”项下分析条件进行检测，记录各共有峰的保留时间及峰面积。结果各共有峰的相对保留时间RSD＜0.05%，相对峰面积RSD＜2.26%。表明样品稳定性良好。

2.4 数据分析

采用国家药典委员会发行2012版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（下简称《相似度评价系统》）对采集到的样品HS-GC/MS 总离子流图进行指纹图谱分析；利用NIST08.L质谱数据库对主要共有峰进行化合物检索；采用SPSS（25.0版本）作进一步数据统计分析；利用Origin 2019b辅助绘图。

3 结果

3.1 化橘红HS-GC/MS 对照指纹图谱建立及样品相似度评价结果

将36 批化橘红样品HS-GC/MS 总离子流图（图1）导入《相似度评价系统》，通过“生成对照”模式，时间窗口设定为0.1 min，以平均数法生成化橘红HS-GC/MS 对照指纹图谱（图2），共标定11 个共有峰（峰编号1－11），各批次样品的共有峰峰面积总和占总峰面积的94.78%～99.27%，其中峰5（柠檬烯）响应值最高且出峰时间稳定，因此设为参比峰（S 峰）。利用《相似度评价系统》分别计算各批样品HS-GC/MS指纹图谱与化橘红HS-GC/MS对照指纹图谱的相似度，结果显示不同类别化橘红样品的相似度不低于0.896（见表2），表明不同类别化橘红样品的挥发性成分具有相似性。

图1 36批化橘红样品HS-GC/MS指纹图谱Figure 1 HS-GC/MS fingerprint of Citri Grandis Exocarpium from 36 samples

图2 化橘红HS-GC/MS对照指纹图谱Figure 2 HS-GC/MS reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium

表2 36批化橘红HS-GC/MS指纹图谱相似度评价结果Table 2 Similarity of Citri Grandis Exocarpium from 36 samples

进一步观察发现正毛、副毛、光果化橘红的HSGC/MS 指纹图谱也存在一些差异，为评价各类别化橘红挥发性成分HS-GC/MS 指纹图谱差异性，进一步利用《相似度评价系统》分别生成正毛化橘红HSGC/MS 对照指纹图谱（图3）、副毛化橘红HS-GC/MS 对照指纹图谱（图4）、光果化橘红HS-GC/MS 对照指纹图谱（图5），除以上11个共有峰外，正毛化橘红另有共有峰14 个（Z1－Z14），副毛化橘红另有共有峰3 个（F1－F3），光果化橘红另有共有峰1 个（G1）。利用《相似度评价系统》分别计算各批样品HS-GC/MS指纹图谱与各类别化橘红HS-GC/MS对照指纹图谱的相似度，以相似度最高者作为判定类别，结果显示判定类别与实际化橘红药材类别一致，利用不同类别指纹图谱相似度判定化橘红药材类别成功率达100%（表2）。

图3 正毛化橘红HS-GC/MS对照指纹图谱Figure 3 HS-GC/MS reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium(Zhenmao)

图4 副毛化橘红HS-GC/MS对照指纹图谱Figure 4 HS-GC/MS reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium(Fumao)

图5 光果化橘红HS-GC/MS对照指纹图谱Figure 5 HS-GC/MS reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium(Guangguo)

利用NIST08.L 质谱数据库对上述共有峰可能所属成分进行检索，并通过对照品比对，进一步确认其中1、2、4、Z3、5、7、Z4、8、9 号峰分别为α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-松油烯、柠檬烯、γ-松油烯、间伞花烃、芳樟醇、β-丁香烯，具体见表3。

表3 化橘红对照指纹图谱共有峰信息Table 3 common peak information of reference fingerprint of Citri Grandis Exocarpium

3.2 化橘红HS-GC/MS指纹图谱聚类分析

将36 批化橘红样品HS-GC/MS 指纹图谱的11个共有峰峰面积导入SPSS（25.0版本），采用组间连接法（Between-groups linkage），以平方欧式距离（Squared Euclidean distance）为测度进行聚类分析。从聚类谱系图（图6）可见，在距离轴为5 时，36 批样品聚为9支，其中12批正毛化橘红聚为2支，12批光果化橘红聚为2支，但其中1支中混进了1批副毛化橘红，而另外11 批副毛化橘红则聚为5 支；在距离轴为10 时，36 批样品进一步聚为5 支，而聚类情况开始变得混杂，其中1支包含了正毛化橘红、副毛化橘红和光果化橘红，1 支包含副毛化橘红和光果化橘红，1 支为正毛化橘红，另有2 支为副毛化橘红。结果未能将3 个类别化橘红分别聚类，表明各类别化橘红组内具有一定离散性，尤其是副毛化橘红组内离散性相对较大。

图6 化橘红HS-GC/MS指纹图谱共有峰聚类分析Figure 6 Cluster analysis of common peaks in HS-GC/MS fingerprint of Citri Grandis Exocarpium

3.3 不同类别化橘红主要挥发性成分特征研究

对比不同类别化橘红HS-GC/MS 对照指纹图谱可见，其中的主要成分β-月桂烯（峰4）、柠檬烯（峰5）、γ-松油烯（峰7）的分布有明显差异特征。进一步采用Origin 2019b 软件对这3 个成分的峰面积比值作绘图分析，以β-月桂烯/柠檬烯、γ-松油烯/柠檬烯、β-月桂烯/γ-松油烯作图，结果显示3 个不同类别化橘红明显分开（图7）。正毛化橘红的γ-松油烯/柠檬烯峰面积比值（0.419 1～0.781 8）显著高于副毛（0.001 7～0.026 4）和光果化橘红（0.006 1～0.062 5）；副毛化橘红的β-月桂烯/γ-松油烯峰面积比值（17.896 7～145.256 3）则显著高于正毛（0.256 0～0.509 6）和光果化橘红（0.505 4～6.654 3）。

图7 不同类别化橘红主要挥发性成分的特征Figure 7 Characteristics of main volatile components in different kinds of Citri Grandis Exocarpium

4 讨论

本研究首次建立了化橘红挥发性成分HS-GC/MS 指纹图谱分析方法，方法重复性、精密度、稳定性良好，操作简便，且检测过程无须使用化学试剂，具有绿色环保的优点。在研究建立HS-GC/MS 分析方法过程中，对样品取样量、顶空样品平衡温度和时间、振摇速度，以及色谱柱类型、进样分离比、柱温升温程序等因素进行了考察。研究发现顶空样品平衡温度对检测影响较大，平衡温度过低，检出峰数量少且响应低，平衡温度超过一定度数后，则出峰数量与峰响应变化不明显，且温度过高会导致样品外观颜色变深并伴有焦糊味，可能影响检测，综合考虑样品出峰数量、峰响应，且尽可能保持样品外观、气味接近原始状态，最终优选顶空进样平衡温度为95 ℃。

道地化橘红的基原为化州柚，传统上化州柚果实重要的性状特征是外果皮密被茸毛，但受品种培育、种植养护、气候等因素综合影响，目前化州柚茸毛特征有了不同的状态，化州地区所产的化橘红有的还保持密被茸毛，有的茸毛密但短小，有的茸毛稀疏或不均匀。产地一般根据外果皮茸毛疏密、长短，分为正毛化橘红、副毛化橘红、光果化橘红等3个类别。本研究结果表明，不同类别化橘红的挥发性成分有相似性，但也存在较明显差异特征，正毛化橘红挥发性成分种类比副毛化橘红、光果化橘红更加丰富。通过构建各类别化橘红药材各自的HS-GC/MS 对照指纹图谱，然后分别计算样品与各类别对照的相似度，以相似度最高者判别药材类别归属，成功率可达100%。进一步对比各类别化橘红HS-GC/MS 指纹图谱中β-月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯3 个主要成分的峰面积发现，正毛化橘红中这3个成分的峰面积都较高，副毛化橘红中β-月桂烯和柠檬烯峰面积较高、γ-松油烯峰面积较低，而光果化橘红中柠檬烯峰面积较高、β-月桂烯和γ-松油烯峰面积较低，因此，通过这3个挥发性特征性成分的相对峰面积比值，尤其是γ-松油烯与柠檬烯峰面积比值，结合β-月桂烯与γ-松油烯峰面积比值，可以判断化橘红药材类别。虽然传统经验鉴别可以根据茸毛疏密、长短对化橘红类别作出快速鉴别，但当药材外观特征被破坏或不明显时，传统经验鉴别方法就未必适用，若在传统经验鉴别基础上，结合现代仪器分析方法，将有助于对药材质量作出更加准确的评价。本研究所建立的化橘红HS-GC/MS 对照指纹图谱和筛选的化橘红挥发性特征成分相对峰面积范围能有效判别不同类别化橘红，具有实际应用价值，可以为化橘红质量评价和规格等级标准建立提供重要方法参考和数据支持。通过对化橘红挥发性成分HS-GC/MS 指纹图谱研究，发现不同类别化橘红中β-月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯的分布存在明显差异特征，这种差异特征是否与其质量等级和药效优劣相关，值得后续进一步深入研究。

不同类别化橘红聚类分析结果与β-月桂烯、柠檬烯、γ-松油烯相对峰面积比值分析结果均显示副毛化橘红挥发性成分的组内离散度相对较大。根据作者实地调研了解，这可能与化橘红品种培育，尤其是砧木、嫁接母本的选择有很大关系，目前化橘红栽培品种众多，加上受环境、种植、养护、加工等各种因素综合影响，使得化橘红药材质量参差不齐。因此，亟需建立化橘红种苗鉴定、培育、种植养护等系列技术标准规范，鼓励优质正毛化橘红品种种植，促进道地化橘红产业的良性发展。

考虑到影响药材内在质量的因素较多，本研究选择在同一基地采集代表性栽培品种的化州柚鲜果，并采用统一加工方法制作成化橘红样品作为研究对象，尽量避免因环境、种植、养护、药材加工等其他因素不同而造成的差异，探索了不同类别化橘红药材的挥发性成分特征，未来仍需要扩大样本范围，以验证本研究结果，并且需要根据后续研究情况，不断修正完善限度范围，以便具有更高普适性。