基于多元统计方法的百合抗氧化谱效关系研究

罗毓，田清清，汪梅，邓李红，胡懿，林伟雄，张正，陈清怡

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

百合为百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.、百合Lilium browniiF. E. Brown var.viridulumBaker或细叶百合Lilium pumilumDC.的干燥肉质鳞叶[1]。现代药理研究表明百合具有抗炎、抗肿瘤、抗抑郁、抗氧化等作用[2-3]。抗氧化作用是日常保健的有效手段之一，氧化应激与癌症、心血管疾病等多种慢性疾病相关[4-5]。在病理条件或环境压力下，需要从外部摄入一定量的外源抗氧剂[6-7]，但由于合成抗氧剂难以确定的毒性和致癌性等缺点，天然抗氧剂更受研究者们的青睐[8]。而百合除了药用外，也是一种常用食材[9]，是一种天然的膳食抗氧化剂。

目前已有研究表明百合的总多酚和总多糖成分具有良好的抗氧化作用[10-12]，但中药是一个多组分、多靶点共同起效的综合体，仅仅是某一有效部位的活性难以全面评估和研究百合抗氧化的药效物质基础。中药谱效关系是将中药指纹图谱与药效有机结合，通过一定化学计量学手段建立谱效关系数学模型，从而确定与药效相关的化合物群，建立反应中药品质的质量评价方法[13]，能够整体全面的反映药材的药效物质基础，控制药材的质量。因此，本研究通过建立百合HPLC指纹图谱，测定百合的抗氧化能力，结合灰色关联分析、Pearson 相关分析以及偏最小二乘回归分析（PLSR）研究其指纹图谱与抗氧化能力的谱效关系。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Arc 高效液相色谱仪（Empower 3 色谱工作站，美国Waters 公司）；KQ-500DE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E 型电子天平、XP26 型电子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司）；111B 型二两装高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）；MiliQ Direct 8 型超纯水机（德国Merck有限公司）。

1.2 材料

王百合苷A（质量分数98.0%，批号STC1510120）、王百合苷C（质量分数98.0%，批号STC5635010），均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；王百合苷B（质量分数98.0%，批号18081001），购自成都普菲德生物技术有限公司。乙腈（色谱纯）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，磷酸（色谱纯）购自科密欧化学试剂有限公司。总抗氧化能力试剂盒（DPPH法、ABTS法）购自苏州格锐思生物科技有限公司。

13 批百合药材均为市售，产地湖南，批号见表1，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为百合科植物卷丹Lilium lancifoliumThunb.、百合Lilium browniiF. E. Brown var.viridulumBaker或细叶百合Lilium pumilumDC.的干燥肉质鳞叶。

表1 13批次百合样品信息Table 1 Information of 13 batches of Lilii bulbus samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件

ZORBAX Eclipse XDB-C18Column 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0～30 min，10%～15% A；30～40 min，15%～20% A；40～55 min，20%～33% A；55～60 min，33%～50%A；60～70 min，50%A；70～71 min，50%～10% A），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长305 nm。

2.2 样品溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的配制 分别取王百合苷A、B、C对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.031 7、0.075 3、0.035 3 mg/mL 的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取百合药材粉末（过三号筛）1.0 g 精密称定置锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声30 min，放至室温，用50%甲醇补足损失质量，摇匀。采用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取百合样品（B1）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，以4号峰（王百合A）为参照峰计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，各共有峰相对峰面积的RSD值均小于5.0%，相对保留时间的RSD值均小于0.2%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取百合样品（B1）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，以4 号峰（王百合A）为参照峰计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，各共有峰相对峰面积的RSD 值均小于5.0%，相对保留时间的RSD 值均小于0.2%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取百合样品（B1）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，在0、2、4、8、12、24 h 照“2.1”项下色谱条件分别进样，以4 号峰（王百合A）为参照峰计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，各共有峰相对峰面积的RSD 值均小于4.8%，相对保留时间的RSD 值均小于0.3%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 共有峰的标定 取13 批次百合，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，取“2.2.1”项下制备的混合对照品溶液，所有样品照“2.1”项下色谱条件进样得各样品色谱图。将13批次百合测定数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 年版）软件，采用平均数法，设置时间宽度为0.10 min，生成百合指纹图谱叠加图，同时生成对照图谱，结果见图1和图2。

图1 混合对照品（A）及百合对照HPLC色谱图（B）Figure 1 HPLC of hybrid reference substances（A）and common mode of Lilii bulbus（B）

图2 13批百合样品的HPLC指纹图谱叠加图Figure 2 HPLC fingerprint overlay of 13 batches of Lilii bulbus

指纹图谱中，共标定17 个共有峰，从峰1 到峰17 各单峰峰面积分别占总峰面积的0.77%、2.44%、5.02%、33.76%、1.08%、0.81%、2.31%、2.57%、1.11%、40.27%、0.66%、0.40%、1.60%、0.43%、0.36%、0.68%、0.48%。非共有峰峰面积总和占总峰面积5.25%。其中4 号峰分离度好，峰面积稳定，响应值高，故定为参照峰。通过与对照品比对，共指认出2、4、10号峰3 个共有峰，分别为王百合苷C、王百合苷A 和王百合苷B。

2.4.2 相似度评价与共有峰差异分析 通过13批次百合指纹图谱形成的共有模式为对照指纹图谱，计算各批次之间的相似度，所有批次相似度均在0.990以上。同时计算相对保留时间和相对峰面积，各共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.3%，相对峰面积RSD 值在9.92%～57.07%，表明同一产地不同批次百合所含主要成分的种类基本一致，质量较为均一，但各批次主要成分含量存在一定差异。

2.5 体外抗氧化活性测定

2.5.1 阳性对照溶液的制备 精密称取维生素C（Vc）31.00 mg 置于100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为阳性对照母液。吸取不同体积母液，用水稀释，制得浓度分别为0.006、0.012、0.021、0.052、0.103 mg/mL 的系列对照品溶液，用于DPPH 自由基清除率的测定；制得浓度分别为0.031、0.062、0.078、0.124、0.155 mg/mL 的系列对照品溶液，用于ABTS自由基清除率的测定。

2.5.2 供试品溶液的制备 按“2.2.2”项下制备供试品溶液，作为母液，吸取不同体积母液，用50%甲醇稀释，制得质量浓度（以生药量计）分别为2.00、5.00、10.00、20.00 mg/mL 的系列样品溶液，连同母液（40.00 mg/mL）用于DPPH 和ABTS 自由基清除率的测定。

2.5.3 自由基清除率的测定 依照DPPH和ABTS自由基清除能力试剂盒说明书，配制工作液，进行反应和测定。只加入样品和无水乙醇为对照组，只加入无水乙醇和工作液为空白组，只加入样品和工作液为测定组，充分振摇。DPPH 自由基避光反应30 min，于517 nm 处测定吸光度（A）。ABTS 自由基避光静置6 min，于734 nm处测定吸光度（A）。按下式计算自由基清除率。

自由基清除率=[1-（Ai-As）/A0]×100%

其中，Ai为测定组吸光度；As为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

使用SPSS20.0 统计软件对13 批次百合测定值做非线性拟合，计算得到半数抑制浓度（IC50），拟合相关系数及IC50值见表2。由表2 可知，相关系数均大于0.990，拟合度均优，说明拟合结果可信度较高。DPPH自由基的IC50值在11.873～21.311 mg/mL范围内波动，其RSD 值为17.08%，ABTS自由基的IC50值在7.723～9.447 mg/mL1范围内波动，其RSD 值为7.38%。百合在两种自由基上的IC50值差异有统计学意义（P＜0.05），对ABTS 自由基的IC50值更小，说明对其清除率更优。

表2 13批次百合样品抗氧化能力结果Table 2 Antioxidant results of 13 batches of Lilii bulbus

Vc对DPPH自由基的IC50值为0.020 mg/mL，对ABTS 自由基的IC50值为0.058 mg/mL，因此百合的抗氧化能力与之相比仍有一定差距，但结合部分相关研究[14-16]，中药提取液对自由基的有效清除浓度（mg/mL）一般在一到数十范围内，故百合的抗氧化能力仍较优，具有一定的研究意义。

2.6 百合指纹图谱与抗氧化活性的灰色关联分析

采用SPSSAU在线数据分析，选择质量浓度（以生药量计）为20.00 mg/mL 的百合溶液对DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率，并将13 批次百合共有峰图谱数据导入SPSSAU。由于数据量纲不相同，为消除量纲导致的偏差，需对数据统一进行无量纲处理，因此选择均值化变换法对导入数据进行处理，将不同批次抗氧化活性（自由基清除率）的药效指标作为母序列，不同批次的共有峰面积作为子序列，软件自动进行处理并计算生成关联度，结果见表3。通常情况下，关联度值越大，表明该评价项与母序列的相关性越强[17]，从表中可以看出，标定的所有共有峰与DPPH 自由基、ABTS 自由基的关联度均大于0.5，说明所有峰均参与自由基清除反应过程，产生正向或负向的作用，最终形成了百合对DPPH自由基、ABTS自由基清除率的结果。为了进一步筛选出与清除率相关更强的共有峰，选择关联度大于0.8的峰并进行排序，共筛选出10个峰，结果如下：对DPPH自由基而言，其关联度大小依次为峰12＞峰14＞峰13＞峰10＞峰5＞峰4＞峰8＞峰9＞峰7＞峰3。对ABTS自由基而言，其关联度大小依次为峰13＞峰12＞峰10＞峰9＞峰5＞峰14＞峰4＞峰3＞峰7＞峰8。从以上结果可初步认定这些共有峰对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率的影响能力基本一致，但由于灰色关联分析无法确定这些峰对自由基清除率产生的是正相关还是负相关的影响，且不同分析手段与计算公式产生的结果可能有所差异，故仍需进行其他相关性分析从而进一步确定各共有峰与DPPH、ABTS自由基清除率的关系。

表3 自由基清除率与百合共有峰峰面积的灰色关联度Table 3 Grey correlation degree between clearance of free radical and common peak area of Lilii bulbus

2.7 百合指纹图谱与抗氧化活性的Pearson 相关性分析

采用SPSS20.0 统计软件以Pearson 相关性分析评价百合指纹图谱共有峰面积与抗氧化活性的相关性，抗氧化活性表征同样选择质量浓度（以生药量计）为20.00 mg/mL 的百合溶液对DPPH 自由基和ABTS自由基的清除率，结果见表4。表中数据显示，与DPPH 自由基清除率相关的峰有8 个（P＜0.05），按照相关系数大小排序为：峰14＞峰12＞峰7＞峰16＞峰15＞峰8＞峰13＞峰1；与ABTS 自由基清除率相关的峰有7 个（P＜0.05），按照相关系数大小排序为：峰13＞峰15＞峰16＞峰7＞峰14＞峰5＞峰17。相关系数均为正值，说明这些共有峰均对百合抗氧化清除能力有提高作用。同样，Pearson相关性结果表明了对DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率有显著性影响的百合共有峰基本一致，且对比灰色关联分析结果，筛选出影响程度较高的共有峰大部分一致，DPPH 自由基相关峰重合率为75%，ABTS 自由基相关峰重合率为71%。

表4 自由基清除率与百合共有峰峰面积的Pearson 相关性结果Table 4 Pearson correlation results between clearance of free radical and common peak area of Lilii bulbus

2.8 百合指纹图谱与抗氧化活性的PLSR分析

以13批百合共有峰峰面积为自变量，质量浓度（以生药量计）为20.00 mg/mL 的百合溶液对DPPH自由基和ABTS 自由基的清除率为因变量，采用SIMCA 14.1 软件进行PLSR 分析，分别建立相关模型。DPPH 自由基清除率的拟合结果为：自变量的累计方差解释率（R2xcum）为0.785，因变量的累计方差解释率（R2ycum）为0.745，模型预测指数（Q2）为0.407。ABTS 自由基清除率的拟合结果为：自变量的累计方差解释率（R2xcum）为0.743，因变量的累计方差解释率（R2ycum）为0.562，模型预测指数（Q2）为0.393。一般认为，R2和Q2超过0.5 表示模型拟合结果较好[18]，以上数据说明DPPH 自由基和ABTS 自由基清除率的模型和预测能力略差。计算百合抗氧化能力PLSR 模型变量投影重要性指标（VIP），对于DPPH 自由基和ABTS 自由基的具体结果见图3。在PLSR模型中，VIP体现变量对模型的整体贡献水平，值越大则贡献水平越大，当VIP＞1 时，一般认为该成分为重要影响指标[19]。从图3 中可以看出，对于DPPH 自由基，VIP 值大于1 的成分包括峰14、峰12、峰11、峰13、峰16；对于ABTS 自由基，VIP 值大于1 的成分包括峰13、峰15、峰16、峰7、峰14、峰17、峰5，通过这两种自由基清除率筛选出的有效成分，有所差异，相同成分为峰13、峰14 和峰16；VIP值虽然可以衡量不同化学成分的重要程度，但无法反映成分与指标间的促进或抑制作用。因此进一步计算不同成分的标准回归系数，结果见图4。通过VIP＞1 筛选出的共有峰，对于DPPH 或ABTS 自由基的清除作用均呈促进关系，说明百合指纹图谱共有峰中，大部分对自由基清除有正向作用。虽然模型拟合系数较差，但通过与灰色关联分析和Pearson相关性分析结果比对，一致性较高。与灰色关联分析比对：与DPPH 自由基清除率相关峰重合率为50%，分别为峰12、13、14，与ABTS自由基清除率相关峰重合率为71%，分别为峰5、7、13、14、15；与Pearson 相关性分析比对，与DPPH 自由基清除率相关峰重合率为83%，分别为峰12、13、14、15、16，与ABTS 自由基清除率相关峰重合率为100%，分别为峰5、7、13、14、15、16、17，说明PLSR 拟合结果的可信度仍比较高。

图3 A.DPPH自由基清除活性的VIP值图；B.ABTS自由基清除活性的VIP值图Figure 3 A.The VIP values of DPPH radical scavenging activity；B.The VIP values of ABTS radical scavenging activity

2.9 与自由基反应前后指纹图谱变化情况

2.9.1 反应前供试品溶液的制备取百合样品B9，按“2.2.2”项下制备供试品溶液。

2.9.2 反应后供试品溶液的制备 取“2.9.1”项下供试品溶液，照“2.5.3”项下分别进行ABTS和DPPH自由基清除反应。反应后采用0.22 μm滤膜过滤，即得。

2.9.3 百合与自由基反应前后图谱测定 取上述反应前后供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定。为了进一步直观地对比百合各共有峰与其抗氧化作用的关系，测定了百合样品B9的溶液在以质量浓度（以生药量计）为40.00 mg/mL 时分别与DPPH 和ABTS自由基反应前后的图谱。由图5可知，百合与DPPH 自由基反应后图谱多个共有峰峰面积减小，部分共有峰完全消失；而与ABTS 自由基反应后图谱仅余峰3、4 和10，且这3 个共有峰峰面积明显减小，说明百合起抗氧化作用是多个共有峰共同作用的结果。对比与DPPH 自由基反应后和ABTS 自由基反应后的图谱，亦可知更多共有峰作用于ABTS自由基，使之被清除，这与ABTS 自由基的IC50值小于DPPH自由基的结果一致。

图5 （A）百合样品B9的指纹图谱；（B）与DPPH自由基反应后的指纹图谱；（C）与ABTS反应后的指纹图谱Figure 5 （A）Fingerprint of B9 sample of Lilii bulbus；（B）Fingerprint after reaction with DPPH radical；（C）Fingerprint after reaction with ABTS radical

3 讨论

自由基学的发展阐明了机体许多功能障碍和疾病与自由基相关，而抗氧剂能有效清除自由基从而达到预防和治疗疾病的目的，且天然抗氧剂比合成抗氧剂具有更低的毒副作用[1]。百合作为极具代表性的药食两用的中药材之一，已有许多关于百合酚酸类成分及百合多糖的抗氧化研究，但缺乏百合各组分抗氧化的作用和规律、明晰主要有效成分之间的协同或拮抗作用的相关研究。中药谱效关系研究被认为是能够解决上述问题的重要手段，因此本研究建立百合指纹图谱并测定体外抗氧化的主要指标——DPPH 和ABTS 自由基清除率，通过多元分析方法将指纹图谱与百合对DPPH 和ABTS 自由基的清除作用进行关联，探讨其谱效关系。

本研究建立了13批百合药材指纹图谱，提取出17 个共有峰，对其中3 个共有峰进行了指认，17 个共有峰相似度均在0.990 以上，说明来源于同一产地的百合质量较为稳定。在建立指纹图谱的试验前期考察了不同提取溶剂（50%甲醇、80%甲醇、50%乙醇、80%乙醇）、提取方式（回流提取和超声）和提取时间（15、30、60 min），优选最佳提取工艺，即50%甲醇超声提取30 min。

DPPH 自由基是一种人工合成的、稳定的有机自由基，呈紫色，结构中存在一个N 原子，其上有一孤对电子[14]，而ABTS 与过二硫酸钾反应后同样会生成呈绿色的、带一孤对电子的自由基[5]，当孤对电子被配对，有颜色的自由基被还原后褪色，其褪色程度与所接受的电子数量呈定量关系，从而通过吸光度变化对抗氧化剂进行定量[15]。采用DPPH 和ABTS 法考察百合的抗氧化活性，13 批次百合清除DPPH 自由基的IC50值在11.873～21.311 mg/mL 之间，RSD 为17.08%，清除ABTS 自由基的IC50值在7.723～9.447 mg/mL 之间，RSD 为7.38%，说明同一产地的抗氧化药效较为均一。此外，百合对ABTS自由基的清除效果优于对DPPH 自由基，这可能与自由基清除机制有关。自由基清除机制基本分为两种[16]，一种是基于H 原子转移，速度较慢，需要一定的时间才能达到反应平衡；一种是基于电子转移，反应迅速。从反应时间上看，ABTS 自由基更多通过电子转移方式实现消除，而DPPH 自由基消除则更可能主要通过抗氧化剂转移氢给自由基。此外，两亲的ABTS 自由基的苯并噻唑结构与DPPH自由基的疏水的芳环结构相比，更容易与多酚类物质发生电子或氢转移，从而对ABTS 自由基表现出更强的清除活性[17]。

为了保证结果的准确性，分别采用灰色关联度、Pearson 相关性分析及PLSR 分析对测得的数据建立百合体外抗氧化活性的谱效关系。根据3种化学计量学方法的分析结果，筛选出相同色谱峰，得出主要影响百合清除DPPH 自由基的共有峰为峰12、13、14 和15；影响百合清除ABTS 自由基的共有峰为峰5、7、13 和14，这些色谱峰对DPPH 和ABTS自由基的清除均有促进作用。百合指纹图谱结果表明占总共有峰峰面积较大的主要成分为王百合苷A（峰4）和B（峰10），分别占总共有峰峰面积的35.5%和42.3%。这两种成分结构相似，均为苯丙素类化合物[24]，但结构上都存在多个羟基，也可被归类为酚酸类化合物，而酚酸类化合物通常也被认为是较好的抗氧化剂[1]。有研究表明[24]王百合苷A 对DPPH 自由基的清除作用表现出与维生素E 相当的效果。但在本研究中，虽然二者峰面积总和约占总共有峰峰面积近80%，研究结果证实其在抗氧化功效上并非为主效成分。推测可能原因为：单一化合物虽然有一定的抗氧化作用，但百合中成分复杂，各组分间存在一定的相互影响，从而导致表现出来的抗氧化效果与单一成分不一致。此外，百合谱效研究的结果表明，百合抗氧化作用与多个成分相关，这与文献研究结果（百合含多种酚酸类成分如绿原酸、没食子酸、咖啡酸等和多糖类化合物，这些成分也都具有较好的抗氧化作用）相一致[10-12]。

本研究初步揭示了影响百合抗氧化作用的主要成分，进一步完善了百合抗氧化活性的物质基础，为百合的质量研究提供参考。同时发现了占总峰面积比重较大的王百合苷A、B并非为清除DPPH和ABTS 自由基的主效成分，可为筛选百合质量标志物提供参考。本研究存在一定的局限性，如指认的化合物较少，不利于进一步深入研究和探讨；该方法的色谱条件下，难以兼顾百合酚酸类和多糖类成分达到更全面比较和筛选抗氧化的药效物质基础的目标，因此有待进一步优化。