锦灯笼配方颗粒UPLC指纹图谱研究

唐双燕，魏家保，赵伟志，郑晓英，张辉，谭沛

（1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518000；2.华润三九现代中药制药有限公司，广东 惠州 516000）

锦灯笼为茄科植物酸浆Physalis alkekengiL.var.franchetii（Mast.）Makino 的干燥宿萼或带果实的宿萼。秋季果实成熟、宿萼呈红色或橙红色时采收，干燥[1]。锦灯笼中的化学成分主要含有甾体、黄酮、氨基酸、生物碱及其他类型化合物[2-4]。其中甾体类、黄酮类为其主要成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血糖等药理作用[5-6]。甾体类化合物是近十年来在锦灯笼植物中发现最多的一类化学成分，主要包括酸浆苦味素类、新酸浆苦味素类和甾醇类化合物，其中以酸浆苦味素类居多且为其特征性化学成分；黄酮类化合物也是锦灯笼中发现比较多的成分之一，包括木犀草苷、木犀草素等[7]。

传统汤剂存在服用、存储、携带不便等问题。中药配方颗粒和传统汤剂相比具有质量稳定、疗效可靠、服用方便、便于携带保管等优势[8-10]。近年来，对锦灯笼的指纹图谱研究也有报道[11-13]，但大多集中在锦灯笼药材的质量控制研究方面，另有邢海燕等[14]仅对锦灯笼饮片标准汤剂特征图谱进行研究，许亮等[15]建立了锦灯笼配方颗粒的木犀草素含量测定方法，均无针对锦灯笼配方颗粒的指纹图谱研究，因此本研究采用超高效液相色谱（UPLC）法建立锦灯笼配方颗粒的指纹图谱，通过共有峰指认，分析不同产地的配方颗粒化学成分差异，从共同监控多种特征性成分的角度出发，建立锦灯笼配方颗粒指纹图谱标准，为锦灯笼配方颗粒质量的整体评价提供思路。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱仪：Thermo Fisher Vanquish UPLC 色谱系统，配置四元泵、自动进样器、色谱柱温箱、二极管阵列紫外检测器、Chromeleon 色谱管理系统；AB Sciex Triple TOF 4600 高分辨质谱仪和Analyst质谱数据处理软件；ME36S百万分之一天平（瑞士梅特勒）；XS204 十万分之一天平（瑞士梅特勒）；SK5200H 超声波仪（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 试剂试药

锦灯笼对照药材（批号：DST181212-026）购于成都德斯特生物技术有限公司；对照品木犀草苷（批号：111720-202111，质量分数：96.6%）、木犀草素（批号：111520-202006，质量分数：94.4%）、酸浆苦味素L（批号：111831-201903）购于中国食品药品检定研究院；对照品酸浆苦味素A（批号：CFS202002，质量分数：98.0%）、4，7-二脱氢新酸浆苦素B（批号：CFS202102，质量分数：98.0%）购于Chemfaces 公司。乙腈为色谱纯，水为超纯水；磷酸、甲醇、乙酸乙酯等其他试剂均为分析纯。

1.3 样品及制备方法

15 批锦灯笼药材分别来源于辽宁省抚顺、黑龙江省哈尔滨、吉林省辽源、陕西省西安、山西省临汾。经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为茄科植物酸浆P.alkekengiL. var.franchetii（Mast.）Makino的干燥宿萼或带果实的宿萼。详细信息见表1。

表1 样品信息及编号Table 1 Sample information and number

锦灯笼配方颗粒制备方法：取锦灯笼饮片4 000 g，加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，再文火煎煮30 min，200 目滤布过滤；药渣再加6 倍量水煎煮25 min，合并2 次滤液，经70 ℃减压浓缩至相对密度1.06～1.12 g/mL 的流浸膏，喷雾干燥（进风温度：150～210 ℃，出风温度：70～115 ℃），加麦芽糊精至1 000 g，混匀，制粒，即得锦灯笼配方颗粒（15 批饮片按此方法制备得到15 批次的配方颗粒，每1 g 颗粒相当于4 g饮片）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为CORTECS UPLC T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流动相为乙腈（A）和0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～7 min，15%A→17%A；7～15 min，17%A→25%A；15～30 min，25%A→28%A；30～32 min，28%A→38%A；32～40 min，38%A→42%A），检测波长220 nm，柱温25 ℃，流速0.30 mL·min-1，进样量为3 μL，理论板数按木犀草苷计算应不低于5 000。

2.2 参照物溶液的制备

称取锦灯笼对照药材1.021 g，置具塞锥形瓶中，加水25 mL，加热回流40 min，取出，滤过，用乙酸乙酯萃取两次，每次25 mL，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，放冷，残渣加70%甲醇水溶液10 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，滤过，取续滤液作为对照药材参照物溶液。另称取木犀草苷4.013 mg、木犀草素4.022 mg、酸浆苦味素A 2.479 mg、酸浆苦味素L 2.577 mg、4，7-二脱氢新酸浆苦素B 2.396 mg，分别加甲醇定容于100 mL 的容量瓶中，作为对照品参照物溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取锦灯笼配方颗粒0.4 g，加水10 mL 使溶解，用乙酸乙酯萃取两次，每次10 mL，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加70%甲醇水溶液10 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 方法学验证

2.4.1 精密度实验 取同一份供试品溶液（批号：S1），连续进样6次，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明，11 个特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD 均小于2%。综合判断，方法的精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批样品（批号：S1），制备6 份供试品溶液，进样分析，记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 结果表明，11 个特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2%。综合判断，方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性考察 取同一份供试品溶液（批号：S1），配制后在第0、4、8、12、16、24 h 进样。记录色谱图，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，11 个特征峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.1 特征峰指认 色谱条件：参照“2.1”项下，将“0.2%磷酸水溶液（B）”优化为“0.2%甲酸水溶液（B）”。质谱条件：采用电喷雾离子源，正、负离子监测模式；喷雾裂解电压3.80 kV；辅助气流量10 mL/min；毛细管温度350 ℃；辅助气温度350 ℃；扫描模式Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；正负离子模式下的碰撞能均为10 eV，质量扫描范围m/z50～1 700。MS/MS 模式时，正负离子模式下的碰撞能均为20 eV，质量扫描范围m/z50～1 250。

参照上述色谱及质谱条件，分别吸取“2.2”项参照物溶液和“2.3”项供试品溶液，对15 批锦灯笼配方颗粒UPLC 指纹图谱11 个共有色谱峰成分进行定性分析，以正、负离子模式扫描供试品，得供试品溶液的ESI-MS 总离子流，见图1。结合文献[16-19]报道和二级质谱裂解碎片的离子信息对特征峰进行识别，经对照品比对，确认色谱峰1 为木犀草苷，色谱峰3 为木犀草素，色谱峰4 为酸浆苦味素A，色谱峰6 为酸浆苦味素L，色谱峰10 为4，7-二脱氢新酸浆苦素B，定位结果见图2。酸浆苦味素类化合物为酸浆属植物的特征性化学成分，根据文献[16-17，20]总结的裂解规律得出，该类化合物的质谱裂解特征主要为丢失CO、CO2、H2O，产生[M-H-H2O]－、[M-H-2H2O]－、[M-H-H2O-CO]－、[M-H-H2O-2CO2]－以及发生RDA 裂解和环的裂解而形成一系列特征离子峰。基于此，对其余特征峰的鉴定分析数据列于表2，为后续特征成分峰的定性提供参考依据。

图1 锦灯笼配方颗粒总离子流图Figure 1 Total ion current diagrams of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

图2 锦灯笼配方颗粒对照品定位液相色谱图Figure 2 Reference location chromatograms of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表2 锦灯笼配方颗粒成分分析结果Table 2 Results of composition analysis of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

2.5.2 指纹图谱的建立 取“1.3”项下15 批锦灯笼药材制备成锦灯笼配方颗粒，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，将实验数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，将各色谱峰匹配，建立对照指纹图谱，15 批锦灯笼配方颗粒对照指纹图谱具有11 个特征峰，共有特征峰峰面积之总和占总峰面积91.4%，表明选定的11 个特征峰可以作为锦灯笼鉴定的标志峰，见图3。根据各峰响应及药效方面所具的代表性，选择以峰1（木犀草苷）参照峰相应的峰为S峰，计算特征峰2－11与S峰相对保留时间，相对保留时间应在规定值的±10%之内，规定值为：2.23（色谱峰2）、2.75（色谱峰3）、3.52（色谱峰4）、3.69（色谱峰5）、4.07（色谱峰6）、4.26（色谱峰7）、4.46（色谱峰8）、4.61（色谱峰9）、5.45（色谱峰10）、6.32（色谱峰11）。

图3 15批锦灯笼配方颗粒共有模式图谱Figure 3 Common pattern chromatograms of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

2.6 相似度评价

中药指纹图谱相似度可以评价各待测样品与能表征中药产品化学组分特征的标准图谱之间的差异化。将15 批锦灯笼配方颗粒图谱中各色谱峰匹配后，建立对照指纹图谱，计算得到各批次与对照图谱的相似度在0.984～1.000，相似度极高，结果表明了15批次样品的化学成分较为类似，没有明显的差异。结果见表3－5。

表3 15批锦灯笼配方颗粒相对保留时间结果Table 3 Results of relative retention time of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表4 15批锦灯笼配方颗粒相对峰面积结果Table 4 Results of relative peak area of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表5 相似度结果Table 5 Similarity results

2.7 聚类分析评价

采用SPSS 22.0 软件，以共有峰的峰面积为变量，采用组间联接法、欧平方式距离对15 批锦灯笼配方颗粒进行聚类分析，结果如图4 所示。根据聚类分析结果，欧式间距小于5 时，15 批锦灯笼配方颗粒样品可以分为4类：第1类为S7、S8、S9，药材产地为山西省临汾市洪洞县；第2 类为S1、S2、S3，药材产地为陕西省西安市蓝田县；第3 类为S4、S10、S11，药材产地为辽宁省抚顺市清原满族自治县和黑龙江省哈尔滨市依兰县；第4 类为S5、S6、S12、S13、S14、S15，药材产地为吉林省辽源市东丰县和黑龙江省哈尔滨市依兰县。当欧式间距增大至15时，陕西省蓝田县和山西省洪洞县样品聚为一类，辽宁省清原满族自治县、黑龙江省依兰县和吉林省东丰县样品聚为一类，由聚类分析的结果可知，共有峰的峰面积与产地分布存在一定关联，即药材产地在地理位置上越接近，配方颗粒间的差异性越小。

图4 系统聚类分析结果Figure 4 Results of systematic cluster analysis

2.8 主成分分析评价

采用SPSS 22.0 软件，以11 个共有峰的峰面积为变量，进行主成分的分析，结果见表6。根据特征值大于1 和贡献率达到85%以上作为提取原则，提取的主成分1 的特征值为6.438，贡献率达到58.525%，提取的主成分2 的特征值为3.245，贡献率达到29.497%，这两个主成分的贡献率达到了88.022%。对成分矩阵进行了具有Kaiser 标准化的正交旋转，见图5，得到11个指标（峰）在2个主成分旋转成分矩阵。成分载荷矩阵的数值及符号代表变量在主成分当中的载荷，载荷越大，表明该化合物在主成分分析中作用越大。由表7结果可知，峰1对主成分1的影响力较大，其中峰1为木犀草苷。峰4对主成分2的影响力较大，峰4为酸浆苦味素A。以主成分1-X轴为例，主成分1主要信息来自距离原点最远的峰1，而主成分2-Y 轴，距离原点最远的为峰4。综上结果，提示木犀草苷和酸浆苦味素A 适宜作为锦灯笼配方颗粒的质量标志物进行含量控制。

图5 旋转成分载荷图Figure 5 Rotating component load diagram

表6 主成分的特征值和方差贡献率Table 6 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表7 旋转成分矩阵Table 7 Rotational component matrix

3 讨论

本实验对梯度洗脱条件、不同色谱柱［CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 100 mm，1.6 μm）、SB RRHD C18（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）、BEH Shield RP18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）、CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 150 mm，1.6 μm）］进行筛选及优化，CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 100 mm，1.6 μm）色谱柱下峰信息量最为丰富，对不同柱温（23、25、27 ℃）、不同流速（0.28、0.30、0.32 mL·min-1）进行考察，流速为0.30 mL·min-1、柱温为25 ℃时各特征峰分离最佳，并对不同仪器（Thermo Fisher Vanquish UPLC 和Agilent 1290Ⅱ）进行验证，各特征峰较为一致且分离好，相对保留时间无偏差，同时采用二极管阵列检测器（DAD）进行全波段检测，发现在220 nm 处，色谱峰数较多且响应值较好。最终选择色谱条件流动相乙腈-0.2% 磷酸水溶液，流速0.30 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长220 nm。

在供试品制备方法考察中对比了不同提取溶剂（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇）、不同萃取溶剂（乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚、正丁醇）。三氯甲烷、乙醚因极性过低，导致萃取时特征峰缺失。水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇提取，乙酸乙酯、正丁醇萃取所得特征峰数量最多且基本一致，均呈现11 个特征峰，共有峰峰面积占总峰面积90%以上，能较好地代表锦灯笼配方颗粒整体质量，并指认了其中5个共有峰，分别为木犀草苷、木犀草素、酸浆苦味素A、酸浆苦味素L、4，7-二脱氢新酸浆苦素B。但经乙酸乙酯萃取富集后的图谱基线平稳，特征峰更容易辨别和指认，因此最终确定了使用乙酸乙酯进行萃取，图谱较为全面的展现了锦灯笼中的甾体类和黄酮类主要化学成分信息，可用于锦灯笼配方颗粒的质量监测。

综上所述，通过建立锦灯笼配方颗粒UPLC 指纹图谱，以相似度结合特征峰的相对保留时间，并使用聚类分析和主成分分析法对不同产地的样品生产制得的配方颗粒质量进行分析，来自山西、陕西、黑龙江、辽宁、吉林5 个产地的锦灯笼药材制备的配方颗粒都具有11 个特征峰，相似度均大于0.980，说明不同产地的锦灯笼成分组成基本一致。由聚类分析的结果可知，共有峰的峰面积与产地分布存在一定关联，即药材产地在地理位置上越接近，配方颗粒所含的成分越接近。主成分分析的结果表明对锦灯笼的质量控制研究可首要关注木犀草苷和酸浆苦味素A 的差异，二者可作为锦灯笼配方颗粒质量控制的质量标志物。本研究为锦灯笼配方颗粒的质量评价和质量控制提供了参考依据。