蓝苓解毒颗粒的质量标准研究

熊青，何佳莹，杨敏

（江西中医药大学附属生殖医院，江西 南昌 330004）

蓝苓解毒颗粒是根据我院陈胜辉主任中医师多年的临床经验总结拟定的中药协定方研制而成，为传统中药制剂。主要由板蓝根、土茯苓、大青叶、薏苡仁、白花蛇舌草、虎杖、醋柴胡、关黄柏和甘草九味中药组成，具有清热解毒[1-3]、利湿通淋之功效。用于湿热下注所致淋证，证见：小便不利，淋漓涩痛，尿血，以及下生殖道感染、慢性前列腺炎见上述证候者。原中药处方中没有固定的质量标准，难以对药品的质量进行控制，为保障临床应用安全，本研究参考《中国药典》2020 年版一部及相关文献[4]，对蓝苓解毒颗粒的质量标准进行了研究。通过对其性状进行规范化描述，并使用薄层色谱鉴别板蓝根[5-6]、关黄柏[7]和虎杖[8]，采用HPLC 测定蓝苓解毒颗粒中（R，S）-告依春[9-11]的含量，制订了可靠有效的含量限度。同时，参照相关文献中颗粒剂的质量检查标准[12-14]，分别对蓝苓解毒颗粒的粒度、水分、溶化性等项目进行检查，确保有效控制该产品质量。

1 仪器与材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪（VWD 检测器）；超声波清洗器（深圳市冠博科技实业有限公司）；万分之一分析天平（METTLER-TOLEDO 公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

（R，S）-告依春对照品（批号：111753-201706）、大黄素对照品（批号：110756-201913）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201814）、甘草苷对照品（批号：111610-201908）、齐墩果酸对照品（批号：110709-201808）、落新妇苷对照品（批号：111798-201805），关黄柏对照药材（批号：120937-201408）、白花蛇舌草对照药材（批号：121183-201605）、薏苡仁对照药材（批号：121254-201504）、柴胡对照药材（批号：120992-201509），均购于中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。硅胶GF254板、硅胶G 板（青岛海洋化工厂分厂，0.20～0.25 mm）。

蓝苓解毒颗粒（批号：20190301、20190302、20190303），均由江西中医药大学附属生殖医院提供。

2 方法与结果

2.1 性状

对3批样品性状进行观察，均为棕黄色粉末；气香，味甜、微苦。见图1。考虑到中药颜色的差异及检验人员主观性，性状拟确定为：本品呈棕黄色至棕褐色；气香，味微苦。

图1 3批样品的性状Figure 1 Traits of three batches of samples

2.2 TLC鉴别

2.2.1 板蓝根的TLC 鉴别 取本品5 g，研细，加80%的甲醇25 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取（R，S）-告依春对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作为对照品溶液。再取除板蓝根外处方比例的其余中药，按处方工艺制备板蓝根阴性样品。称取适量板蓝根阴性样品，照供试品溶液的制备方法同法制成板蓝根阴性对照溶液。分别吸取上述供试品、对照品和阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点分离度较好，阴性无干扰（见图2）。

图2 板蓝根TLC图Figure 2 TLC of Isatidis Radix

2.2.2 关黄柏的TLC 鉴别 取本品2 g，研细，加甲醇25 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加盐酸10 mL使溶解，用乙酸乙酯15 mL提取两次，水层用氨试液调节pH 至10，再用三氯甲烷15 mL 提取2 次，三氯甲烷液水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取关黄柏对照药材，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，作为对照药材溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。再取除关黄柏外处方比例的其余中药，按处方工艺制备关黄柏阴性样品。称取适量关黄柏阴性样品，照供试品溶液的制备方法同法制成关黄柏阴性对照溶液。分别吸取上述供试品、对照药材、对照品和阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以正丁醇-冰乙酸-水（7∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点分离度较好，阴性无干扰（见图3）。

图3 关黄柏TLC图Figure 3 TLC of Phellodendri Amurensis Cortex

2.2.3 虎杖的TLC 鉴别 取本品3 g，研细，加甲醇30 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇2 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取大黄素对照品，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作为对照品溶液。再取除虎杖外处方比例的其余中药，按处方工艺制备虎杖阴性样品。称取适量虎杖阴性样品，照供试品溶液的制备方法同法制成虎杖阴性对照溶液。分别吸取上述供试品、对照品和阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-乙醇（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，斑点分离度较好，阴性无干扰（见图4）。

图4 虎杖TLC图Figure 4 TLC of Rhizoma Polygoni Cuspidati

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Welch C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.02%磷酸水溶液（6∶94）；检测波长245 nm；流速1.0 mL·min-1；进样量10 μL。

2.3.2 样品的处理与配制 对照品溶液的配制：精密称取（R，S）-告依春对照品适量，加甲醇配制成质量浓度为10 g·mL-1的（R，S）-告依春对照品溶液，备用。供试品溶液的制备：取装量差异项下的内容物研成粉末，取约8 g，精密称定，放在具塞的锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，盖上塞子，称定质量，超声处理30 min，取出，室温放置至凉，再称定锥形瓶和样品的质量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，用漏斗过滤，取滤液过0.45 μm 的微孔滤膜，取续滤液作为蓝苓解毒颗粒含量测定的供试品溶液。缺板蓝根阴性溶液的制备：取缺板蓝根阴性样品适量，照“供试品溶液的制备”方法制备，即得。

2.3.3 专属性试验 取（R，S）-告依春对照品溶液、供试品溶液和缺板蓝根阴性溶液各10 μL，分别注入液相分析，记录色谱图并保存，结果见图5。结果显示本品系统适应性良好，（R，S）-告依春保留时间约在25 min，与其他各峰达到基线分离，且阴性无干扰，理论塔板数＞5 000，符合方法学要求。

图5 HPLC图谱Figure 5 HPLC chromatograms

2.3.4 线性关系考察 配制浓度为2.040 μg·mL-1的（R，S）-告依春对照品储备溶液。分别精密吸取对照品储备溶液1、2.5、4、5、7.5 mL，放于10 mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为2.004、5.010、8.016、10.020、15.030 μg·mL-1线性溶液，分别将上述对照品溶液及对照品储备液（20.040 μg·mL-1）各10 μL，注入液相中分析，记录峰面积。以峰面积对进样量（ng）进行回归分析，回归方程为：y=6.603 9x-17.444，R2=0.999 3，结果表明（R，S）-告依春在20.04～200.40 ng 范围内与峰面积线性关系良好，符合方法学要求。

2.3.5 精密度试验 取（R，S）-告依春对照品溶液，连续注入液相色谱仪6 次，记录色谱图的峰面积。结果显示，峰面积的平均RSD值为1.73%，小于5%，本方法精密度良好，符合方法学要求。

2.3.6 重复性试验 取蓝苓解毒颗粒样品（批号：20190302）6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下方法测定，计算含量。结果显示，样品含量平均RSD 值为1.75%，小于5%，本方法重复性结果良好，符合方法学要求。

2.3.7 稳定性试验 取供试品溶液，按“2.3.1”项下方法，分别在0、2、4、8、12、18、24 h 后进样测定，记录峰面积。结果显示平均RSD 值为1.91%，表明供试品溶液24 h 内稳定，本方法稳定性良好，符合方法学要求。

2.3.8 加样回收率试验 取已知含量的蓝苓解毒颗粒（批号：20190302，每1 g 含（R，S）-告依春0.050 4 mg）各6个样品，每个样品取4 g，精密称定，分别精密加入1 mL（R，S）-告依春对照品溶液（0.232 6 mg·mL-1），挥干，按供试品溶液的处理方法同法制成6份加样回收样品，注入液相分析，计算加样回收率，结果见表1。结果显示，6个样品加样回收率平均RSD＜5%，本方法加样回收率良好，符合方法学要求。

表1 加样回收率试验结果Table 1 The results of sample recovery

2.3.9 耐用性试验 取样品（批号20190302）进行耐用性试验，分别在不同流速、柱温、流动相比例条件下测定（R，S）-告依春含量，结果见表2。由结果可知，不同流速、柱温和流动相比例对（R，S）-告依春的含量测定结果无显著性差异，说明本法耐用性好。

表2 耐用性试验结果Table 2 Durability test results

2.3.10 样品含量测定 测定3 批样品的（R，S）-告依春含量，结果显示，批号20190301、20190302、20190303的样品含量分别为0.60、0.60、0.59 mg·袋-1，3 批样品均符合规定，且无明显差异。

2.3.11 含量限度《中国药典》2020 年版一部板蓝根项下规定：水分不得过13.0%，含量按干燥品计算，含（R，S）-告依春不得少于0.030%。本品每1 袋中含板蓝根5.001 6 g，（R，S）-告依春的转移率约为30%。考虑到大生产环节中的损耗等因素，以24%转移率计算，本品每袋含（R，S）-告依春为0.313 3 mg。故拟将本制剂含量限度定为：本品每袋含板蓝根以（R，S）-告依春计，不得少于0.31 mg。因此3批样品的含量均符合规定。

2.4 其他检查

照《中国药典》2020 年版通则0104 颗粒剂项下要求，对3 批中试样品（批号：20190301、20190302、20190303）的粒度、水分、溶化性、装量差异和微生物限度等项目进行检查。

2.4.1 粒度测定 照粒度和粒度分布测定法（《中国药典》2020年版通则0982第二法筛分法）测定，不能通过一号筛的量与能通过五号筛的量的总和不得过15%。 结果显示，批号20190301、20190302、20190303 的样品粒度检查结果分别为2.0%、2.1%、2.0%，3批样品的粒度检查结果均＜15%，符合规定。

2.4.2 水分测定 照水分测定法（《中国药典》2020年版通则0832）测定，水分不得超过8.0%。取供试品内容物，进行水分测定，结果显示，批号20190301、20190302、20190303 的样品水分分别为4.0%、4.1%、4.2%，3 批样品的水分测定结果均＜8.0%，水分检查结果均符合规定。

2.4.3 溶化性测定 照溶化性测定法（《中国药典》2020 年版通则0104 颗粒剂）测定，取供试品1 袋，加热水200 mL，搅拌5 min，立即观察。结果显示，3批样品颗粒全部溶化，有轻微浑浊，溶化性检查结果符合规定。

2.4.4 装量差异测定 照《中国药典》2020 年版通则0104 颗粒剂（装量差异）项下规定，取供试品10 袋，除去复合膜袋包装，分别精密称定每袋含有的内容物，求出每袋中含有的内容物装量与平均装量，每袋装量与平均装量相比较，规定6.0 g以上装量差异限度为±5%，超出装量差异限度的颗粒剂不得多于2 袋，并不得有1 袋超出装量差异限度1 倍。结果显示，3批样品的装量差异均在±5%以内，均符合相关规定。

2.4.5 微生物限度测定 照《中国药典》2020 年版颗粒剂检查项和微生物计数法、控制菌检查法及非无菌药品微生物限度标准检查，蓝苓解毒颗粒为不含药材原粉的口服给药制剂，其检出需氧菌总数不得超过103cfu·g-1，霉菌和酵母菌总数不得超过102cfu·g-1，每1 g中不得检出大肠埃希菌。

蓝苓解毒颗粒微生物限度检查方法：取本品10 g，置锥形瓶中，加pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，保温振摇，作为1∶10 供试液。取1∶10 供试液按平皿法（1 mL·皿-1），依法测定需氧菌总数；取1∶10 供试液按平皿法（1 mL·皿-1），依法测定霉菌和酵母菌总数；取1∶10 供试液10 mL 至100 mL胰酪大豆胨液体培养基，依法检查大肠埃希菌。结果显示，3 批样品检出需氧菌总数不超过100 cfu·g-1，霉菌和酵母菌总数不超过10 cfu·g-1，均未检出大肠埃希菌。表明3批样品的微生物限度检查均符合规定。

2.4.6 重金属检查 照《中国药典》2020 年版通则0821 重金属检查法，对样品中含有的重金属进行相关检查。结果表明，3 批样品的重金属均未超过百万分之十，低于药典标准限量。

2.4.7 砷盐检查 照《中国药典》2020年版通则0822砷盐检查法，对样品进行检查，结果表明，3批样品的砷盐均未超过百万分之二，低于药典标准限量。

3 讨论

质量标准研究过程中，曾对处方中的土茯苓、白花蛇舌草、醋柴胡、甘草、薏苡仁等药味进行了薄层鉴别方法的研究。土茯苓的鉴别以落新妇苷对照品，白花蛇舌草的鉴别以白花蛇舌草为对照药材、齐墩果酸为对照品，醋柴胡的鉴别以北柴胡为对照药材，甘草的鉴别以甘草苷为对照品，薏苡仁的鉴别以薏苡仁为对照药材，结果阴性样品皆有干扰，且改变展开剂及样品提取方法效果不明显，故未作为质量控制指标。

板蓝根、关黄柏和虎杖的TLC 鉴别过程中，分别对点样量、点样后的温度和湿度进行考察。鉴别板蓝根时，供试品溶液和对照品溶液点样量为10 μL 时斑点明显；鉴别关黄柏时，供试品溶液和对照品溶液点样量为2 μL 时斑点明显；鉴别虎杖时，供试品溶液和对照品溶液点样量为1 μL 时斑点明显。不同温度的考察：取点样后的薄层板，分别在温度10 ℃、温度35 ℃条件下进行试验，结果发现不同温度下分离效果无显著性差异。不同湿度的考察：取点样后的薄层板，分别在相对湿度42%、相对湿度88%条件下进行试验，结果发现不同湿度条件下分离效果无显著性差异。这表明以上3种药材的鉴别方法在温湿度条件变化较大时，仍具有较好的稳定性和适宜性。

蓝苓解毒颗粒源自医院协定处方，该方根据湿热下注所致的淋证的临床辩证，按照中医理论和多年临床经验，由古代经典名方“四妙散”加减而成。经工艺开发，将汤剂研制成颗粒剂，在临床上为广大患者提供有效、经济、安全的用药选择。

4 结论

本研究建立了蓝苓解毒颗粒中主要成分板蓝根、关黄柏和虎杖的TLC鉴别方法，并采用HPLC法测定了（R，S）-告依春的含量。此方法专属性强、重复性好、准确度高，能够有效评价蓝苓解毒颗粒的质量。使得该制剂的质量标准更加完善，能够全面有效地控制其质量。