多重位点特异性PCR 法同时鉴别牛膝和川牛膝配方颗粒

黄上书，罗宇琴，宋叶，范耀耀，雷欣荷，2，李国卫，陈向东

（1.广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244；2.广东药科大学中药学院/国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室/广东（省）教育厅高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006）

牛膝和川牛膝为我国常用中药，均有补益肝肾和行瘀达下的功效，其中牛膝以补益肝肾为主，而川牛膝以行瘀达下为主，临床上需区别使用[1-2]。两者药材差异明显，均能通过性状、显微鉴别[3-5]、理化鉴别[6]、指纹图谱如红外光谱法或X 射线衍射法[7]等进行区分。牛膝、川牛膝配方颗粒分别由牛膝Achyranthes bidentataBl.、川牛膝Cyathula of‐ficinalisKuan[3]饮片经水提、浓缩、制粒等现代工艺制成，已不具备中药饮片性状、显微特征[8-9]等，加之两者化学成分类似，均以三萜皂苷类、甾酮类、糖类等成分为主，其紫外光谱和蛋白质指纹图谱也相似[7]，难以通过传统鉴别方法进行区分。据文献报道，尚风琴等[10]采用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）建立了两者的指纹图谱，通过图谱的含量、结构信息能够区别牛膝和川牛膝药材。孟虎彪等[11]报道了适用于配方颗粒的牛膝、川牛膝特异性PCR 鉴别方法，能进行牛膝和川牛膝配方颗粒的特异性鉴别，但该法未能解决牛膝和川牛膝互相掺伪的问题。因牛膝和川牛膝的临床适用差异较大，且两者在外观形态上相似，易被误用[12]，特别是制成配方颗粒后，鉴别难度进一步加大。因此，为进一步完善质量控制体系，需建立一种能够快速同时鉴别牛膝和川牛膝配方颗粒的方法。

多重PCR 可同时扩增和检测多个目标片段，可鉴别多个物种是否存在相互掺杂。该法已广泛应用于多个领域，如对石斛[13]、九里香[14]、海马[15]等多基原中药的鉴别，对苍耳子[16]、重楼[17]、金钱白花蛇[18]、地龙[19]及其伪品的鉴别，以及对人参、三七、西洋参[20]等的掺杂检测。本研究旨在建立一种能够同时鉴别牛膝和川牛膝原料及配方颗粒的多重位点特异性PCR 鉴别方法，通过一次PCR 反应即可对牛膝、川牛膝及其互相掺伪进行鉴别。

1 材料

1.1 仪器

BioSpec-nano 紫外分光光度计（岛津公司）；StepOne Real-time PCR 仪（Thermo Scientific公司）；ABI MiniAmp Plus 型PCR 仪（Thermo Scientific 公司），T100 PCR仪（Bio-Rad公司）。

1.2 试剂和试药

2×Pfu PCR Master Mix DNA（批号：KP201）、2 ×Taq PCR Master Mix（批号：KT201）聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司，2×M5 Supper Fast‐Taq PCR Master Mix（批号：MF164）购自北京聚合美生物科技有限公司，Multiplex PCR 5×Master Mix（批号：M0284S）购自NEU ENGLAND Biolabs 公司；DNA Marker DL1000（批号：3591A）购自Takara公司；高效植物基因组DNA 提取试剂盒（批号：DP350）购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 供试品

牛膝和川牛膝药材各10批，来自河南、内蒙古、河北、四川、重庆、湖北等不同地区；牛膝和川牛膝配方颗粒各10 批，均来自广东一方制药有限公司。药材样本经广东一方制药有限公司孙冬梅主任鉴定。样本信息见表1。

表1 牛膝和川牛膝样本信息表Table 1 Sample information of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2 方法与结果

2.1 引物设计

参考文献[11]所选牛膝引物进行研究，并下载NCBI数据库的牛膝和川牛膝ITS序列，比对并筛选出两者的SNP 位点，使用Primer Premier 5 软件设计了川牛膝特异性鉴别引物。引物信息见表2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 牛膝和川牛膝特异性引物Table 2 Specific primers of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.2 DNA提取

2.2.1 牛膝和川牛膝药材 取药材细粉0.1 g，使用改良CTAB 法[11]提取总DNA，使用BioSpec-nano 测定DNA，调整浓度至100 ～300 ng/μL。

2.2.2 牛膝和川牛膝配方颗粒 取配方颗粒细粉0.3 g 于15 mL 离心管中，加入预热的CTAB 沉淀液（2.0% 十六烷基三甲基溴化铵，100 mmol/L Tris-盐酸pH 8.0，20 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠pH 8.0)5 mL，混匀，65 ℃水浴加热1 h（期间混匀2～4次），离心，12 000 r/min，5 min，弃去上清液；再加入CTAB沉淀液5 mL，重复操作1次；沉淀置于新的2 mL离心管中，再使用植物DNA提取试剂盒提取总DNA。

2.3 单重引物特异性验证

分别对牛膝及川牛膝配方颗粒的特异性引物进行验证，其中牛膝参考文献[11]条件，川牛膝PCR扩增体系25 μL：2×MightyAmp Buffer 12.5 μL，引物F/R 各0.3 μL，Mighty Amp（1.25 U/μL）0.3 μL，DNA 模板（100～300 ng）1 μL，去离子水补足至25 μL。PCR 扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环；最后72 ℃延伸5 min。待PCR 扩增反应结束后，取PCR 产物6 μL 经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，经GelRed 显色，最后于凝胶成像仪观察记录结果。其中牛膝特异性PCR 结果见图1，川牛膝特异性PCR结果见图2。可见，牛膝及川牛膝特异性PCR 均在目标条带有单一的DNA目标条带，说明该方法特异性较好。

图1 牛膝位点特异性PCR法样品电泳图Figure 1 Electropherograms of the allele-specific PCR assay of Achyranthes bidentata

图2 川牛膝位点特异性PCR法样品电泳图Figure 2 Electropherograms of the allele-specific PCR assay of Cyathula officinalis

2.4 多重PCR条件考察

将牛膝及川牛膝确定的特异性PCR 引物组合进行调试，通过单因素试验分别考察不同退火温度、不同循环次数、不同引物量、不同PCR 仪及不同DNA 聚合酶对多重PCR 鉴别的影响。反应体系25 μL：2×Pfu PCR Master Mix 12.5 μL，牛膝上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，川牛膝上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA 模板（100～300 ng）1 μL，灭菌超纯水9.5 μL。PCR 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；循环反应31次（95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s），最后72 ℃再延伸5 min。PCR 产物经GelRed 预染的3%的琼脂糖凝胶电泳，于成像仪观察结果。

2.4.1 退火温度 分别考察退火温度为56、58、60 ℃时，对牛膝和川牛膝配方颗粒的鉴别影响，结果见图3，牛膝和川牛膝分别获得187 bp 和164 bp 的条带，且阴性及空白无干扰，为保证方法的稳定性，确定多重PCR退火温度为58 ℃。

图3 退火温度及循环次数对牛膝和川牛膝多重PCR鉴别的影响Figure 3 Effect of annealing temperature and cycles on identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis by multiplex PCR

2.4.2 循环次数 当循环次数为29～33 次时，牛膝及川牛膝均可获得相应的目标条带，见图3，为保证方法的稳定性，选择31次循环。

2.4.3 引物量 分别考察牛膝和川牛膝引物量均为0.8、1.0、1.2 μL 时对多重PCR 的影响，结果见图4，牛膝及川牛膝均可获得相应的目标条带，因此确定牛膝和川牛膝引物用量均为1.0 μL。

图4 不同引物量及不同仪器对牛膝和川牛膝多重PCR鉴别的影响Figure 4 Effect of different primers and instruments on multiplex PCR identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.4.4 PCR 仪 使用上述确定的PCR 方法在不同PCR 仪上考察方法的耐用性。结果见图4，使用不同型号的PCR 仪，均能获得正确的鉴别结果，由于多重PCR 对退火温度较为敏感，应对PCR 仪进行温度校正[19]。

2.4.5 DNA聚合酶体系 使用上述确定的PCR方法考察不同酶（2×Pfu PCR Master Mix、2×Taq PCR Master Mix、2×M5 Supper FastTaq PCR Master Mix、Multiplex PCR 5×Master Mix）对结果的影响。结果见图5，使用2×Pfu 酶能够获得正确的结果，因此选择2×Pfu PCR Master Mix DNA聚合酶体系。

图5 不同DNA聚合酶对牛膝和川牛膝多重PCR鉴别的影响Figure 5 Effect of different DNA polymerases on multiplex PCR identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.5 适用性与灵敏度试验

2.5.1 适用性考察 采用建立的方法对上述牛膝和川牛膝药材及配方颗粒样品进行多重位点特异性鉴别，结果见图6，牛膝供试品均可获得187 bp 的特异性条带，川牛膝供试品均可获得164 bp 的特异性条带，阴性及空白无干扰。

图6 牛膝和川牛膝多重PCR鉴别适用性试验Figure 6 Applicability test of multiplex PCR for identification of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis

2.5.2 灵敏度考察 为考察方法的灵敏度，分别取牛膝及川牛膝药材、牛膝及川牛膝配方颗粒DNA样品以99∶1、95∶5、90∶10、80∶20、50∶50、20∶80、10∶90、5∶95、1∶99 比例混合，按“3.1”项下确定的方法进行多重PCR 鉴定，结果见图7。结果表明，在牛膝药材中掺入1%川牛膝药材，在川牛膝药材中掺入5%牛膝药材，均能明显检出；在牛膝配方颗粒中掺入50%川牛膝配方颗粒，在川牛膝配方颗粒中掺入10%牛膝配方颗粒，均能明显检出。

图7 牛膝和川牛膝多重PCR鉴别掺伪检测限考察Figure 7 Detection limit for adulteration of Achyranthes bidentata and Cyathula officinalis by multiplex PCR

3 讨论

本研究以配方颗粒的掺伪或混伪鉴别为目的，通过多重PCR 法建立了牛膝和川牛膝配方颗粒的鉴别体系，能有效地从药材-配方颗粒进行传递，保证从源头到成品基原的准确性。在DNA 提取考察中，牛膝和川牛膝配方颗粒均含有大量多糖，其水提取物黏性较大，且DNA提取过程中残留的辅料可能对PCR 扩增存在一定影响。本研究使用CTAB沉淀液进行样品的预处理，降低辅料干扰，再通过试剂盒或其他方法纯化DNA，获得的DNA 质量较好。说明该方法适用于含多糖较高样品的DNA提取。

建立的多重PCR 鉴别方法中牛膝和川牛膝分别可扩增出187 bp 和164 bp 的特异性条带，说明该方法的鉴定准确率为100%，对牛膝药材以及川牛膝药材的最低检测限为均为5%（6 ng），且在牛膝药材中掺入1%川牛膝药材，在川牛膝药材中掺入5%牛膝药材，均能明显检出，说明该方法能有效用于原料的控制。

此外，在牛膝配方颗粒中掺入50%川牛膝配方颗粒，在川牛膝配方颗粒中掺入10%牛膝配方颗粒，也均能明显检出。表明该方法对于牛膝或川牛膝配方颗粒的掺杂鉴定灵敏度均较低，可能与配方颗粒经过加热提取后大部分DNA 被破坏有关。此外，川牛膝药材多重PCR 鉴别结果在400～700 bp 存在非特异性扩增条带，而单重特异性鉴别中仅164 bp 存在目标条带，说明两者药材多重PCR 方法中存在非特异性扩增，但在配方颗粒中非特异性扩增干扰较小，因此该法对配方颗粒的鉴别较好。本研究建立的牛膝和川牛膝配方颗粒多重PCR 鉴别方法能够通过一次PCR 反应即可对牛膝、川牛膝及其互相掺杂进行鉴别，为牛膝和川牛膝配方颗粒的质量控制提供了参考。