鬼针草调节PI3K-Akt 信号通路改善急性肺损伤作用的分子机制研究

周加林，于淼，李伟，舒尊鹏，王毅

（1.北京市第六医院中药房，北京 100007；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006）

急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是严重的肺部炎性疾病之一，多种疾病均可引起ALI，严重的还可进一步发展成急性呼吸窘迫综合征，从而导致机体出现低血压、凝血功能异常、舒张性休克甚至死亡[1]。其临床症状主要表现为肺浸润、低氧血症和肺水肿等，具有高发病率、高病死率的特点[2]，对人类健康事业造成了不可忽视的威胁。因此寻找新的治疗方案仍是目前急需解决的问题。近年来中医药展现了独特的优势，尤其在新冠肺炎疫情中发挥了不可替代的作用，中医药治疗ALI 成为潜在的可行方案。

鬼针草（Bidens bipinnataL.）是菊科植物鬼针草的全草，俗称鬼钗草、婆婆针、黏身草等，始载于《本草拾遗》《中药大辞典》中记载鬼针草“味苦，平，无毒”。鬼针草具有清热解毒、散瘀活血等功效，可用于上呼吸道感染、感冒、炎症等[3]。有研究表明鬼针草的主要活性物质为黄酮类化合物[4]，黄酮是一类重要的含氧杂环天然有机化合物，具有抗炎、抗肿瘤、心脑血管保护等丰富的药理活性[5]。鬼针草的抗炎作用主要体现在抑制炎症早期的水肿和渗出，抑制炎症晚期的组织增生和肉芽组织的形成[6]。目前，有研究表明鬼针草提取物可通过抑制TGF-β1/Smad3/Angptl4 信号通路，从而改善急性胰腺炎大鼠肺损伤[7]。然而，对于鬼针草治疗内毒素引起ALI 的研究相对较少，其作用机制尚未阐明。

本研究通过腹腔注射脂多糖（LPS）诱导ALI 小鼠模型，采用经典药效学方法确证鬼针草对ALI 具有改善作用，通过网络药理学技术预测鬼针草发挥改善ALI 作用的潜在药效物质基础及作用机制，并通过分子生物学技术对潜在作用通路的关键靶点进行验证。本研究采用网络药理学技术结合分子生物学技术探讨鬼针草对ALI 的作用及机制，为鬼针草的进一步研究及开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

LPS，大肠杆菌055：B5，批号：L2880，购自美国Sigma-Aldrich 公司；IL-6、IL-1β和TNF-α酶联免疫分析试剂盒（批号分别为H007-1-2、H002-1-2、H052-1-2）、髓过氧化物酶（MPO）测试盒（批号：A044-1-1），购自南京建成生物工程研究所有限公司；TRIzol 试剂购自Life technologies 公司（批号：15596-018）；磷酸化的Akt兔抗购自affinity 公司（批号：AF6261）；HRP 标记山羊抗兔二抗（批号：GB23303）和组化试剂盒DAB 显色剂（批号：G1212-200T）购自武汉塞维尔生物有限公司。

1.2 药物配制

称取鬼针草原药材500 g，先进行剪碎，然后加入3 L 的蒸馏水浸泡2 h，再煎煮1.5 h。煎煮完成后用纱布进行过滤，得到第1次药液；药渣再加入1.5 L蒸馏水煎煮1.5 h，并用纱布进行过滤，得到第2次药液。将两次所得的药液进行合并，旋转浓缩蒸发至含生药质量浓度为1 g/mL的浓缩液。

1.3 腹腔注射LPS诱导的ALI小鼠模型的建立

选取体质量为（22±2）g 的SPF 级雄性Balb/c 小鼠60只，购自广州中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（粤）2018-0034。实验期间，以《实验动物管理条例》为准则进行动物实验。本实验经广东药科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：gdpu‐lacspf2017692）。实验环境温度控制在（22±2）℃，相对湿度为（50±5）%，12 h 交替照明，动物自由饮水、进食，保持垫料干燥。按体质量随机分为6 组，每组10 只，分为空白对照组（Con）、LPS 模型组（M）、鬼针草低（2 g/kg）、中（4 g/kg）、高（8 g/kg）剂量组、地塞米松阳性药组（Dex，5 mg/kg）。除空白组外，模型组和给药组小鼠腹腔注射LPS（5 mg/kg）[8]，空白对照组腹腔注射相同体积的PBS缓冲液。造模12 h后，按相应给药剂量组分别灌胃给药治疗5 d，每天1 次，其中空白对照组和模型组分别灌胃生理盐水。第6天麻醉后，进行摘眼球取血。取完血后，颈部脱臼处死，然后摘取肺组织。

1.4 肺组织病理切片观察

为评价肺组织的组织学变化，将组织用PBS 清洗3次，4%（φ）多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片4 μm，苏木精伊红（H&E）染色。光镜下观察肺组织病理变化。肺组织病理学评分细则[9]：以肺泡厚度、肺组织损伤及炎症细胞浸润为评价指标，0 分代表最小损伤、1 分代表轻度损伤、2 分代表中度损伤、3 分代表重度损伤、4 分代表最大损伤。肺损伤的严重程度根据3个指标之和来评价。

1.5 肺组织中MPO活性测定

按MPO 检测试剂盒说明书对小鼠肺组织中的MPO 活性进行测定。在460 nm 处测量吸光度（A）值的变化来计算MPO活性，以此来评估其肺部细胞浸润情况。

1.6 网络药理学分析

1.6.1 鬼针草化合物和ALI靶点的搜集 通过TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和BATMAN（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）数据库以及中国知网，以鬼针草为关键词对相关化合物进行查找，将以上数据库中的活性成分通过口服生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18 进行初步筛选，并结合相关研究与文献内容对成分进一步剔除或补录，从而得到鬼针草的成分数据。将查找到的化合物导入到PubChem 数据库中筛选相关靶点，并通过STP 数据库导入化合物的结构预测潜在作用靶点。在TTD（Therapeutic Target Database）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca）、GenGerd（http：//gen‐ecards.org/）等疾病数据库中以ALI为关键词检索其疾病靶点。

1.6.2 交集靶点的筛选 将搜集到的ALI 疾病靶点和鬼针草药物作用靶点输入到VENNY2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）数据库中进行映射，得到药物与疾病的交集靶点及其韦恩图。

1.6.3 PPI 网络互作图的制作 将得到的药物与疾病交集靶点复制黏贴到STRING 数据库中进行分析，得到的分析结果导入Cytoscape3.9.1 中利用“network analyze”功能进行分析得到介度值和中心度值等数据，通过Degree 值排序后，制作鬼针草治疗ALI的PPI网络互作图。

1.6.4 鬼针草化学成分分析 将搜集到的鬼针草与疾病对应靶点的化合物按度值大小和化合物类型进行整理，并对排名靠前，与鬼针草治疗ALI的密切相关的化合物进行分析，并通过Cytoscape3.9.1制作“成分—靶点—通路”复合网络。

1.6.5 鬼针草化合物GO 分析与KEGG 分析 将鬼针草的化合物与疾病靶点的交集靶点集合导入DAVID 数据库中进行GO 分析和KEGG 分析，再将分析结果整理后导入到微生信平台得到GO 分析生物过程气泡图和KEGG分析通路气泡图。

1.7 细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的活性测定

取-80 ℃冻存的血清，按照ELISA 试剂盒说明书分别测定TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

1.8 肺组织中Akt mRNA表达量测定

采用实时荧光定量PCR 法（RT-qPCR）对小鼠肺组织中相关基因进行测定，用TRIzol 试剂说明书来分离和纯化总RNA，用Takara 公司试剂盒除去基因组DNA 反应、按照PrimeScriptTMRT 试剂盒及SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行荧光定量PCR检测。引物序列如表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence table

1.9 免疫组织化学分析

用免疫组织化学染色法检测p-Akt 的表达水平。石蜡切片在封闭液（10%正常兔血清+5%脱脂奶粉+3%BSA+0.1%Triton X-100）中孵育10 min，然后加入一抗在4 ℃孵育过夜。用pH 7.4的PBS冲洗后，加入辣根过氧化物酶（HRP）-山羊抗兔IgG 抗体（1∶200）在室温下孵育50 min。切片与二氨基联苯胺在显色底物上孵育，苏木精反染。采用图像分析技术，计数光学显微镜200×倍视野下阳性细胞数。随机选择5 个视野，取每视野内平均阳性细胞数作为计数标准。

1.10 统计方法

所有数据均以表示。使用GraphPad Prism 8.0 软件（GraphPad，CA，USA）进行图形处理。采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鬼针草在体内对LPS诱导的ALI的保护作用

为了探究鬼针草对ALI 的干预作用，本研究对肺组织病理切片进行观察。结果如图1A 所示，与空白对照组相比，模型组肺组织结构完整性被破坏，出现肺泡间质水肿、肺泡壁增厚、肺泡内大量炎症性细胞浸润等情况。鬼针草及阳性药干预后能明显减轻症状，其中鬼针草高剂量组效果最为明显。肺组织病理学评分见图1B，与空白对照组相比，模型组的病理学评分显著升高（P＜0.05），鬼针草及阳性药干预后，均出现显著性回调（P＜0.05），鬼针草的改善作用呈剂量依赖性。与空白对照组相比，模型组肺组织中MPO 活性显著增强（P＜0.05），鬼针草能够抑制MPO 活性。上述结果说明鬼针草能够改善ALI 小鼠肺组织病理结构，并抑制炎性浸润。

图1 鬼针草在体内对LPS诱导的ALI的保护作用Figure 1 Protection of Bidens bipinnata L.on LPS-induced ALI in vivo(n=6)

2.2 鬼针草化合物及其靶点与疾病靶点映射分析及PPI网络分析

通过中国知网和TCMSP、PubChem、STP 等数据库查找到91 种化合物及其相关靶点582 个。并在Drugbank、OMIM 等疾病数据库中搜查到659 个ALI 的相关靶点。将鬼针草对应的靶基因582 个与ALI 相关靶点659 个，进行韦恩图绘制得到交集靶点115 个，即为鬼针草改善ALI 的关键靶点（结果如图2A 所示）。通过运用STRING 数据库，对获得的115 个关键靶点构建PPI 网络。通过自由度（Degree值）进行排名，自由度值越高，代表两者之间关系越密切。结果如图2B 所示，其中Degree 值前10 的靶点为TNF、IL-6、ALB、GAPDH、AKT1、VEGFA、STAT3、MAPK3、EGFR、CASP3。这些靶点可能在鬼针草改善ALI中起着重要作用。

图2 鬼针草-ALI交集靶点映射及PPI分析结果Figure 2 Intersection target mapping and PPI analysis results of Bidens bipinnata L.and ALI

2.3 鬼针草改善ALI的潜在作用机制分析

将PPI 分析中115 个关键靶点进行了GO 分析，结果如图3A 所示。在生物过程中，inflammatory response、negative regulation of apoptotic process、positive regulation of interleukin-8 production、response to hypoxia、positive regulation of smooth muscle cell proliferation 是显著富集；在细胞成分组成中，plasma membrane、cytoplasm、membrane raft、macromolecular complex、cell surface 是显著富集；而在分子功能方面，identical protein binding、enzyme binding、protein binding、protease binding、protein phosphatase binding 是显著富集。上述结果提示鬼针草可能通过调节炎症反应、细胞凋亡等生物过程来发挥改善ALI的作用。

图3 鬼针草改善ALI的GO分析及KEGG分析图Figure 3 GO and KEGG analyses of Bidens bipinnata L.improving ALI

此外，将PPI 分析中115 个关键靶点，在DAVID数据库进行KEGG 通路富集分析，选取其中密切程度前15 的通路进行分析。结果如图3B 所示，HIF-1 signaling pathway、C-type lectin receptor signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway、VEGF signaling pathway、Chemokine signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway等途径是显著富集。其中，经过查阅相关的文献，发现PI3K-Akt 信号通路与ALI 密切相关，这提示鬼针草可能通过调节机体PI3K-Akt信号通路来改善ALI。

2.4 鬼针草主要活性成分分析

运用Cytoscape 软件构建鬼针草改善ALI 作用机制的“成分—靶点—通路”网络，阐明鬼针草中的活性成分通过作用于关键靶蛋白从而调控信号通路，进而发挥改善ALI作用的体内分子机制，该机制网络如图4 所示。鬼针草用于治疗ALI 的化合物中，主要是黄酮类，其次为萜类和脂肪酸类。其中，黄酮类中与ALI 最密切的为木犀草素和槲皮素；萜类中多梗白菜菊素、芳樟醇（D）；脂肪酸类中以亚油酸最为密切。

图4 鬼针草改善ALI作用机制的“成分—靶点—通路”网络图Figure 4 “Component-target-pathway”network diagram of Bidens bipinnata L.improving ALI

2.5 鬼针草可抑制ALI的炎症反应

为了探究鬼针草对ALI 炎症反应的改善作用，检测了ALI 血清炎症因子（TNF-α，IL-1β和IL-6）的活性，结果如图5 所示。腹腔注射LPS 诱导ALI 血清中TNF-α，IL-1β和IL-6 的活性显著上升，在鬼针草及阳性药的干预下，均出现不同程度的回调，并呈现剂量依赖性，其中鬼针草高剂量组的效果最佳。以上结果表明鬼针草可有效减轻ALI小鼠的肺部过度性炎症反应，从而发挥改善ALI的作用。

图5 鬼针草可抑制ALI的炎症反应Figure 5 Inhibition of Bidens bipinnata L.in the inflammatory response of ALI(n=6)

2.6 PI3K-Akt信号通路关键靶点验证结果

在网络药理学的预测结果分析中发现PI3KAkt 信号通路是显著富集。因此，采用RT-qPCR 及免疫组织化学的方法，对PI3K-Akt信号通路中关键靶点Akt 进行验证，结果如图6 所示。与空白对照组相比，模型组肺组织中Akt 的转录及表达显著降低（P＜0.05）。在给予鬼针草干预后，肺组织中Akt的转录及表达显著升高（P＜0.05）。提示鬼针草可能通过激活PI3K-Akt信号通路来改善ALI。

图6 鬼针草对ALI小鼠肺组织Akt转录及蛋白表达的影响Figure 6 Effect of Bidens bipinnata L.on Akt transcription and protein expression in lung tissue of ALI mice(n=6)

3 讨论

ALI是一种以肺部炎症和肺组织结构破坏为病理特征的呼吸系统危重病[10]。现有研究表明，ALI以急性肺部“炎症风暴”为主要病理特征，极易随着病程发展成为急性呼吸窘迫综合征，导致肺组织功能衰竭，致使病情加重危及生命[11]。目前用于治疗ALI 的药物其临床表现均不够理想，因而寻找安全有效的治疗药物仍为当今ALI研究领域的热点。鬼针草作为传统中草药，已被证实具有显著的抗炎作用[12]。然而，鬼针草改善ALI 的有效成分及其作用机制尚未阐明。

本研究结果表明鬼针草可改善ALI小鼠肺组织结构损伤，显著抑制肺组织MPO 及血清TNF-α，IL-1β和IL-6的表达，从而缓解机体的炎症反应。在石振国等[7]的研究中，鬼针草提取物可通过抑制肺组织MPO 活性及TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子的表达，从而改善急性胰腺炎大鼠肺损伤，与本研究结果一致。

此外，网络药理学预测分析得到鬼针草改善ALI的主要活性成分可能为黄酮类化合物。现有研究表明，鬼针草总黄酮可减少机体TNF-α，IL-6等炎症因子产生，提高IL-10 的含量，从而抑制炎症反应，减轻ALI[13]。在本研究中，网络药理学分析得出槲皮素和木犀草素与鬼针草改善ALI密切相关。其中槲皮素可抑制TNF-α、IL-8等炎症因子过度释放，减轻肺水肿病理改变，从而减轻ALI[14-15]。而木犀草素可降低肺组织中的IL-6 和TNF-α等炎性因子的水平，减轻肺组织病理损伤，从而缓解ALI[16]。根据PPI分析，TNF、IL-6、ALB、GAPDH、AKT1、VEGFA、STAT3、MAPK3、EGFR、CASP3 等为网络中核心靶点，可能是鬼针草治疗急性肺损伤的关键靶点。Akt为蛋白激酶，是PI3K 的下游受体，在细胞增殖、分化、凋亡、迁移和转录等多种细胞过程中发挥重要作用[17]。此外，STAT3的激活在炎症、细胞增殖、凋亡、血管生成、转移和免疫应答中具有关键作用[18]。

KEGG 分析结果得出PI3K-Akt 信号通路显著富集。现有研究表明PI3K-Akt 信号通路在肺炎症细胞存活和氧化应激中发挥重要作用，其通过调控多个下游靶点干预线粒体功能障碍、调节细胞自噬、抑制细胞凋亡及缓解肺组织细胞氧化损伤及炎症反应，从而治疗ALI[19]。Akt 作为PI3K-Akt 信号通路一个关键靶点，其活性下调与细胞炎性反应密切相关，而Akt的激活可降低机体细胞氧化应激，并抑制炎症因子的释放[20]。本研究中，通过RT-qPCR及免疫组织化学方法对PI3K-Akt 信号通路关键靶点Akt 进行验证，结果发现鬼针草可促进Akt 的转录及表达。因此，鬼针草可能通过促进Akt的表达，从而激活机体PI3K-Akt 信号通路，进而发挥改善ALI作用。

综上所述，本研究通过药效学方法确证了鬼针草对腹腔注射LPS 诱导ALI 具有改善作用，其可改善ALI小鼠肺组织结构损伤，显著抑制肺组织MPO及血清TNF-α，IL-1β和IL-6 的表达，从而缓解机体的炎症反应。网络药理学预测分析得出其发挥作用的潜在药效物质基础可能为黄酮类化合物中的槲皮素和木犀草素。此外，鬼针草可促进肺组织Akt 的表达，从而激活机体PI3K-Akt 信号通路来发挥肺保护作用。这为鬼针草治疗ALI提供了实验依据，以便后续开展相关验证研究。